广东甘薯疮痂病病原菌鉴定

[目的]明确广东甘薯疮痂病的病原菌种类及生物学和系统发育学特征,为甘薯疮痂病防治及抗病育种提供参考.[方法]从广东省茂名和湛江等甘薯产区采集甘薯疮痂病植株,采用分生孢子悬液梯度稀释分离法分离病原菌,通过病原菌的形态特征观察、致病力测定,结合核糖体内转录间隔区(ITS)、28S核糖体RNA(LSU)、RNA聚合酶II第二大亚基(rpb2)和翻译延伸因子1-α(TEF1)部分序列的多核苷酸序列系统学分析等方法对病原菌进行鉴定.[结果]共分离获得26株单分生孢子分离物,随机选取3株代表性菌株SPEb-1、SPEb-2和SPEb-3进行观察和测定.光学显微镜下观察发现,3株代表性菌株的产孢细胞透明,内生芽殖;分生孢子单细胞,透明,短棒形,两侧顶端钝圆,大小为6.1~9.0μm×2.2~3.0μm;分生孢子梗短棒状;致病性人工接种表明,3株代表性菌株均可侵染甘薯引起典型的疮痂病症状.3株代表菌株的ITS、LSU、rpb2和TEF1序列与痂囊腔菌属(Elsino?)的E.ampelina、E.bidentis、E.arachidis、E.mimosae、E.ricini和E.sesseae等多个种的对应序列一致性为95%~99%.系统发育进化树分析结果显示,3株代表性菌株与蓖麻痂囊腔菌(E.ricini)单独聚成一支.[结论]广东甘薯疮痂病的病原菌为甘薯痂囊腔菌(E.batatas).     

侵染广东连州葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子特征 及致病性分析

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列（GenBank登录号：KX883801）设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F：CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R：TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F：AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R：AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F：GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R：GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶（61—3 495 nt）、186K复制相关蛋白（61—5 007 nt）、运动蛋白MP（4 994—5 788 nt）和外壳蛋白CP（5 763—6 248 nt）。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物（GenBank登录号：KY753928）同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。     

番茄黄化曲叶病毒侵染危害海南番茄及其分子特征

[目的]明确引起海南三亚、东方和陵水番茄黄化曲叶病的病毒分子特征,为防控该病害提供科学依据.[方法]以2019年2月从海南三亚、东方和陵水采集的15份疑似番茄黄化曲叶病样本为材料,采用菜豆金色花叶病毒属病毒的通用简并引物AV494/CoPR对15份样本进行PCR检测,并对PCR检测为阳性的样本进行滚环扩增(RCA)及基因克隆,获得侵染海南三亚、陵水和东方番茄的病毒基因组全序列,进而在GenBank数据库BLASTh程序进行相似性比对,利用SDT 1.2的MUSCLE alignment进行序列相似性比较分析,采用MEGA 6.0的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育进化树,明确所获得病毒分离物与已报道分离物的亲缘关系.[结果]获得侵染海南三亚、陵水和东方番茄的3个番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)分离物基因组全序列,其大小均为2781 nt,编码6个开放阅读框(ORF),其中病毒链上AV1和AV2基因,互补链上AC1、AC2、AC3和AC4基因.相似性比对分析结果表明,TYLCV海南分离物与墨西哥和美国分离物的相似性在99.0%以上,与来自我国不同省(市)的14个TYLCV分离物的相似性在98.0%以上.系统发育进化分析显示,海南三亚、陵水和东方3个分离物与墨西哥、美国及我国北京和江苏分离物聚集在一个小分支,进一步与来自我国其他12个省(市)、韩国、哥斯达黎加和澳大利亚的分离物形成一个分支.[结论]侵染海南番茄的TYLCV可能来自我国大陆的番茄等种苗和烟粉虱带毒传入,也有可能来自墨西哥和美国等其他国家.     

基于小RNA深度测序技术鉴定侵染广东辣椒的病毒种类

【目的】病毒病是广东省辣椒生产上主要病害之一,田间病株率一般为5%—30%,严重时可达100%。本研究旨在探明危害广东辣椒的病毒种类,为辣椒病毒病的防控提供理论依据。【方法】2013—2016年,从广东省广州、佛山、惠州、江门、梅州、湛江、茂名和韶关8市辣椒主要种植区采集疑似病毒病辣椒样品125份,分别提取每份辣椒病样总RNA,对从茂名、梅州、韶关3市采集的病样按地点和症状混合成7份混合病样进行小RNA深度测序分析,根据小RNA深度测序分析结果,对每种病毒分别根据小RNA深度测序拼接的基因片段序列和GenBank数据库中与该拼接序列同源性最高的病毒基因组序列保守区设计2对特异性引物,以小RNA深度测序的病样RNA为模板进行RT-PCR扩增,根据扩增效果对引物进行筛选,进一步应用筛选出的引物,对采集于广东省的125份辣椒病样分别进行RT-PCR检测,根据检测结果明确危害广东辣椒的病毒种类。【结果】从采集于广东省8市的辣椒主要种植区的125份病样中检测到14种病毒,按照检出率从高到低依次为辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus,PMMoV）(44.0%）、甜椒内源RNA病毒（Bell pepper endornavirus,BPEV）（32.8%）、烟草轻型绿花叶病毒（Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）（31.2%）、辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）（29.6%）、辣椒黄脉病毒1（Pepper vein yellow virus 1,PeVYV-1）（26.4%）、甜椒斑驳病毒（Pepper veinal mottle virus,PVMV）（25.6%）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）（18.4%）、辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus,ChiRSV）（16.8%）、辣椒黄脉病毒6（Pepper vein yellow virus 6,PeVYV-6）（16.8%）、马铃薯 Y 病毒（Potato virus Y,PVY）（15.2%）、辣椒褪绿病毒（Capsicum chlorosis virus,CaCV）（14.4%）、蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2,BBWV-2）（9.6%）、辣椒隐症病毒1（Pepper cryptic virus 1,PCV1）（8.8%）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）（4.0%）。其中,PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1和PVMV 6种病毒的检出率在25%以上,但PMMoV、ChiVMV和PVMV分布广泛,PMMoV除了茂名外,ChiVMV除了韶关外,其他7市辣椒产区均有分布;PVMV广泛分布于8市辣椒产区,根据检出率和分布范围,得出PMMoV、ChiVMV和PVMV是危害广东辣椒的优势病毒。同时发现,广东辣椒上多种病毒复合侵染现象普遍,在本研究125份病样中病毒复合侵染率达到88.0%,其中2种、3种、4种、5种、6种、7种和8种病毒复合侵染检出率分别为28.0%、25.6%、12.0%、9.6%、6.4%、1.6%和2.4%,由此可知,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。【结论】危害广东辣椒的病毒有14种,其中PMMoV、ChiVMV和PVMV为优势病毒,且复合侵染普遍,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。     

城市广场人性化设计探讨

城市广场是城市绿地的重要组成部分,是城市居民重要的活动场所之一.探讨"以人为本"的内涵,分析时代对城市广场提出的要求及当前广场存在的问题,阐述了人在城市广场上的活动需求,着眼于人的最终发展提出人性化广场设计的原则.     

广东枣疯病植原体的鉴定

Several jujube plants with witches′ broom, little leaf, and big bud symptoms, which were likely infected by jujube witches′ broom (JWB) phytoplasma, were collected in Guangzhou, Guangdong Province. To identify the pathogen, PCR was performed using phytoplasma 16S rDNA universal primer pairs R16mF2/R1 and P1/P7 and SecA gene primer pair SecAfor1/rev3 with total DNA of the symptomatic plants as templates. Specific fragments, 1.4 kb, 1.8 kb, and 0.8 kb in length, were amplified from one of three symptomatic samples. Phylogenetic analysis based on 16S rDNA verified that the pathogen harming jujube plants in Guangzhou was jujube witches′ broom phytoplasma which belonged to 16SrV-B subgroup. Comparison results also showed that the 16S rDNA sequence of Guangzhou JWB phytoplasma shared the highest nucleotide identity (100%) with the reported jujube witches′ broom phytoplasma Japanese strain (AB442218) and JWB strain (AY197661) and shared the nucleotide identity ranging from 99.74% to 99.80% with the other JWB phytoplasma strains. In addition, phylogenetic analysis based on SecA also showed that Guangzhou jujube witches′ broom phytoplasma belonged to 16SrV-B subgroup and shared 99.28%-99.76% similarity with other phytoplasma strains. All these results suggested that jujube witches′ broom phytoplasma has infected jujube plants in Guangdong Province.     

侵染萝卜的油菜花叶病毒广东分离物分子特征及其致病性分析

【目的】病毒病是萝卜（Raphanus sativus）生产上的主要病害之一,严重危害萝卜生产安全及产业发展。本研究旨在鉴定侵染广东萝卜的病毒种类,探究侵染萝卜的油菜花叶病毒（youcai mosaic virus,YoMV）分子特征及致病性,为萝卜病毒病的防控提供科学依据。【方法】从广东省惠州市萝卜种植基地采集了3个疑似病毒病侵染的萝卜病样及1个无症状样品,提取样品总RNA,利用小RNA深度测序初步探明病毒种类,然后根据测序结果设计病毒特异引物进行RT-PCR验证。应用分段克隆方法扩增病原病毒YoMV基因组1—3 405 nt片段和3 194—6 304 nt片段,然后通过同源重组克隆到pCB301双元载体上,得到YoMV-GD分离物基因组全长序列,同时构建该病毒分离物的侵染性克隆。利用MEGA7软件对YoMV-GD及其他分离物全长核苷酸序列进行系统进化分析。通过侵染性克隆人工注射接种本生烟和普通烟,检验pCB301-YoMV-GD的侵染性,然后再注射接种萝卜和菜心,测定YoMV-GD分离物的致病性。【结果】侵染广东萝卜的病毒包含萝卜隐状病毒3（Raphanus sativus cryptic virus 3,RsCV3）、萝卜黄病毒1（Raphanus sativus chrysovirus 1,RasCV1）、芜菁花叶病毒（turnip mosaic virus,TuMV）、YoMV 4种;YoMV-GD分离物全长序列为6 304 nt,编码4个蛋白,分别为124.7 kD复制相关蛋白、183 kD复制酶、30 kD运动蛋白MP、17.7 kD外壳蛋白CP,与YoMV英国分离物（GenBank登录号：AY318866）核苷酸相似性最高,为99.18%;YoMV-GD分离物与英国、德国及我国上海、重庆分离物的亲缘关系较近;构建的侵染性克隆pCB301-YoMV-GD可以系统侵染本生烟和普通烟,引起严重的坏死、枯斑等症状,具有较强的侵染性;YoMV-GD可以系统侵染萝卜和菜心,引起轻微的黄化和花叶等症状,致病力较弱。【结论】侵染广东萝卜的病毒包含RsCV3、RasCV1、TuMV和YoMV,且以复合侵染形式存在;YoMV遗传进化并没有明显的地域性;YoMV-GD对烟草致病力较强,而对萝卜和菜心致病力较弱。     

侵染广东省葫芦科作物的中国南瓜曲叶病毒的分子特征

【目的】中国南瓜曲叶病毒（squash leaf curl China virus,SLCCNV）是危害葫芦科作物的主要病毒之一,可侵染南瓜、葫芦、冬瓜、黄瓜、甜瓜、哈密瓜,严重影响葫芦科作物生产。论文旨在探究SLCCNV广东分离物的分子特征、亲缘关系及其致病性,为SLCCNV的防控提供科学依据。【方法】从广东省湛江市雷州市和徐闻县、惠州市博罗县、河源市源城区以及佛山市高明区共采集53份疑似感染菜豆金色黄花叶病毒属（Begomovirus）病毒的葫芦科作物病样,提取总DNA,利用菜豆金色黄花叶病毒属通用引物AV₄₉₄/CoPR进行PCR检测。选取PCR检测为阳性的样品进行RCA扩增、酶切、克隆及测序,获得各分离物基因组A组分（DNA-A）的全长序列;同时利用背向引物PCR扩增、克隆及测序,获得各分离物基因组B组分（DNA-B）的全长序列。将得到的SLCCNV广东分离物DNA-A和DNA-B全长序列在NCBI中进行BLAST分析,利用SDT1.2软件MUSCLE alignment方法对序列相似性作进一步比较分析,应用MEGA7软件对获得的SLCCNV广东分离物及已报道的SLCCNV分离物进行系统发育分析。采用同源重组技术,构建SLCCNV河源南瓜分离物的侵染性克隆,通过农杆菌介导注射接种南瓜子叶,测定其致病性。【结果】PCR检测结果表明,53份疑似病样中有52份感染了菜豆金色黄花叶病毒属病毒;进一步从南瓜、葫芦、冬瓜以及白瓜4种葫芦科作物病样中分别克隆获得8个SLCCNV广东分离物基因组全序列,DNA-A组分全长大小为2 735—2 739 nt,含有6个ORF,与已报道SLCCNV相同。DNA-B组分大小为2 701—2 721 nt,含有2个ORF,分别编码与病毒运动相关的蛋白BC1和BV1。序列相似性比较结果显示,广东不同分离物DNA-A组分核苷酸序列相似性在94.9%以上,与已报道的SLCCNV其他分离物的相似性在88%以上;所获得的DNA-B组分核苷酸序列相似性在86.7%以上,与已报道的SLCCNV其他分离物的相似性在83%以上。系统发育分析结果显示,8个广东分离物与来自中国广西、河南、海南、越南、泰国、菲律宾、印度尼西亚的分离物亲缘关系近,同属于一个分支,而与来自印度的分离物亲缘关系较远。致病性测定结果表明,接种后15 d（dpi）,接种南瓜植株的新叶开始出现了皱缩症状;30 dpi,接种南瓜植株表现典型的曲叶病症状,PCR检测均为阳性,Western blot检测进一步验证了上述结果。【结论】在广东检测到SLCCNV侵染多种葫芦科作物,SLCCNV是引起广东南瓜曲叶病的病原。SLCCNV广东分离物与广西、海南等分离物亲缘关系近,同属于一个分支,而与来自印度的分离物亲缘关系较远。