湖南桃江病圃92个稻瘟病菌株遗传多样性分析

【目的】利用抗瘟水稻品种是防治稻瘟病最有效措施,了解稻瘟病菌遗传多样性是抗病品种合理布局的重要基础。【方法】本研究于2015年在湖南桃江病圃采集水稻品种"丽江新团黑谷"(LTH)稻瘟菌病样,用单孢分离法分离稻瘟病菌单孢并纯化获得92个单孢菌株,利用14对SSR引物对其进行遗传多样性分析。【结果】在0.19相似水平,92个供试菌株可被划分在同一遗传宗谱内;在0.70相似水平,92个菌株可被划分成26个遗传宗谱,优势宗谱XIX内含有17个菌株,占总菌株数的18.48%,宗谱Ⅳ、XVIII中分布包含10、9个菌株,分别占总菌株数的10.87%、9.78%;其他23个宗谱内各含1~5个菌株。【结论】综合表明,湖南桃江病圃的稻瘟病菌遗传差异较大,个别菌株亲缘关系较远,遗传结构比较复杂。     

稻曲病菌休眠与非休眠厚垣孢子的MSAP分析

本研究以稻曲病菌Ustilaginoidea virens黄色(非休眠)厚垣孢子、黑色(休眠)厚垣孢子、厚垣孢子萌发后产生的分生孢子(非休眠)3种孢子为材料,采用DNA甲基化敏感扩增多态性技术对供试材料基因组DNA进行甲基化分析,探究稻曲病菌休眠与非休眠厚垣孢子DNA甲基化的水平和模式。结果显示,3种形态孢子的基因组DNA甲基化水平差异明显,分生孢子基因组DNA中CCGG序列的总甲基化率为20.56%,黑色休眠厚垣孢子为25.63%,黄色非休眠厚垣孢子为33.52%。黄色和黑色的厚垣孢子主要是全甲基化模式,其全甲基化率高于半甲基化率,其中黄色厚垣孢子全甲基化率高达17.68%;分生孢子则是以半甲基化模式为主。结果对揭示稻曲病菌厚垣孢子休眠的分子机制,探究真核生物孢子的分子休眠机制有普遍意义。     

湖南48个水稻栽培品种抗瘟性评价及抗性基因鉴定

为了明确48个湖南种植品种的抗瘟性和抗瘟基因型,选用10株已明确其无毒基因组成的稻瘟病单孢菌株对湖南稻区48个水稻品种进行离体接种试验;分析菌株对48个水稻品种的毒力频率,并作出其抗瘟性评价和抗瘟基因型的初步推定。结果表明,48个品种对10株菌株抗瘟性存在较大差异,毒力频率在0～60%之间,供试菌株对丰两优4号(VF=60%)、粤禾丝苗(VF=50%)、隆两优534(VF=50%)为较强毒力,对34个水稻品种中等毒力(20%≤VF50%),占试验总数的70.83%,对11个品种表现为弱毒力(VF20%),占试验总数的22.92%。在相似系数0.70水平上,可将48个品种划分为31谱系;通过稻瘟病菌与品种"基因对基因"关系的推断,抗瘟基因型Pi-1、Pi-a、Pi-7、Pi-3、Pi-i、Pi-11、Pi-19普遍存在于各水稻谱系中,出现频率高;Pi-5、Pi-t、Pi-k~p抗性基因出现频率比较低;抗性基因Pi-ta出现频率最低。     

枯草芽胞杆菌YN145分离鉴定及抑菌活性

为挖掘用于稻瘟病防治的微生物资源,从感病水稻品种湘早籼24号的健康植株茎叶中用稀释分离法获得527个菌株。采用平板对峙法筛选出对稻瘟病菌具有拮抗作用的菌株60个,其中菌株YN145对稻瘟病菌菌丝生长抑制率达84.31%。经形态学和生理生化鉴定及16S rDNA序列分析,将菌株YN145鉴定为枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis。生物活性测定表明,该菌株继代培养25代后,对稻瘟病菌菌丝抑菌效果仍在80%以上。菌株YN145发酵离心上清液经40、60、80、100和120℃处理30 min后,对稻瘟病菌的抑制率分别为91.50%、92.35%、91.78%、90.93%和86.97%;同样发酵上清滤液分别在pH 3、5、7、9和11处理30 min后,对稻瘟病菌的抑制率分别为91.50%、92.92%、92.92%、92.35%和92.63%。表明抗菌物质能耐高温、耐酸碱,菌株YN145作为稻瘟病生防制剂研发具有一定的价值。     

湖南桃江病圃稻瘟病菌对24个水稻抗稻瘟基因的毒性分析

稻瘟病是水稻生产上的重要病害,了解稻瘟病菌群体毒性组成是水稻抗病品种合理布局的重要基础。2012-2015年从湖南桃江病圃中不含已知抗瘟基因的水稻品种‘丽江新团黑谷’上成功分离出351个稻瘟病菌单孢菌株,在温室于水稻5叶期采用离体接种法测定了其对24个水稻抗稻瘟病单基因系的毒性,结果表明,病圃中稻瘟病菌以广谱强致病性的菌株为主,病菌对不同抗瘟基因的毒力频率在50.56%~96.67%之间,而不同年度间对24个抗性基因均具毒性的菌株出现频率在0~15%之间。对2015年的每2个抗瘟基因的联合毒力分析表明,基因两两搭配后的联合抗病系数最高、联合致病系数最低的组合是Pi-3*Pi-k(RAC=0.19,PAC=0.43)。     

湖南50个水稻栽培品种的抗瘟性及抗瘟基因型推定

选用了16个含已知稻瘟病菌无毒基因单孢菌株对湖南栽培的50个水稻品种进行苗期离体接种鉴定,基于其抗感表型,分析了16个菌株对水稻品种的毒力频率,并依据"基因对基因"理论,对水稻品种进行了抗瘟基因型推定。结果表明,16个菌株对50个供试水稻品种的毒力频率(FV)介于31.25%~93.75%之间。其中,健优8号抗性相对较强,抗谱稍广,推荐在湖南省水稻生产作业中合理使用。通过DPS软件进行聚类分析,在0.75相似系数水平,50个供试的水稻品种被划成24类。其中,出现频率最高的抗性基因为Pi-20。     

特基拉芽胞杆菌JN-369抗菌粗蛋白的理化性质和抑菌效果

特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis JN-369是1株对稻瘟病菌Magnaporthe oryzae有较好拮抗作用的植物内生细菌，其发酵液经硫酸铵沉淀后得到抗菌粗蛋白。为明确菌株JN-369抗菌粗蛋白的抑菌机理，首先确定了该抗菌粗蛋白抑菌谱、热稳定性、酸碱稳定性、紫外稳定性以及酶稳定性，并观察研究了抗菌粗蛋白对稻瘟病菌菌丝和分生孢子的抑制作用。并采用针刺离体接种法测定了40%稻瘟灵EC、25%三环唑WP及不同浓度JN-369抗菌粗蛋白对水稻稻瘟病的拮抗效果。结果表明：菌株JN-369抗菌粗蛋白抑菌谱广，对葡萄灰霉病菌、草莓灰霉病菌和水稻稻瘟病菌等13种植物病原真菌及卵菌表现出抑制作用，而对油菜菌核病菌没有抑制作用；该粗蛋白理化性质相对稳定，具有应用于粮食作物生物防治的潜力；对稻瘟病菌的菌丝生长和分生孢子萌发有双重抑制作用，能使病原菌菌丝细胞膨大，并可抑制病菌分生孢子的萌发；离体防效试验显示，供试杀菌剂对水稻稻瘟病均有显著的拮抗效果，菌株JN-369抗菌粗蛋白在浓度为50～100 μg/mL时对稻瘟病的拮抗效果最好，该菌株有望开发为防治稻瘟病的生防菌株。     

枯草芽孢杆菌JN005胞外抗菌物质及对水稻叶瘟防治效果

【目的】检测枯草芽孢杆菌JN005产生的胞外抗菌物质的稳定性和对稻瘟病菌的生物活性,及其对水稻叶瘟的防治效果。【方法】通过不同培养基检测枯草芽孢杆菌JN005产生的抑菌物质,结合平板对峙法、光学显微镜观察、室内离体和活体接种来检测JN005菌株胞外抗菌物质对稻瘟病菌拮抗活性和对水稻叶瘟防治效果。【结果】枯草芽孢杆菌JN005能分泌蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和β-1, 3-葡聚糖酶,其胞外抗菌物质对稻瘟病菌生长具有抑制作用。胞外抗稻瘟病菌物质在0℃~100℃和pH 2~12范围内活性较为稳定,且经蛋白酶K处理后不影响其活性,紫外照射12 h以及4℃保存3个月仍有活性。胞外抗菌物质能引起稻瘟病菌菌丝形态畸变,并抑制分生孢子的萌发。室内湘晚籼12号稻瘟病离体叶片接种表明,先用100倍胞外抗菌物质稀释液处理水稻叶片,24 h后接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液(1×10⁵个/mL),其叶瘟发病率为34.07%,效果接近稀释500倍的40%稻瘟灵EC;而先接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液,24 h后用100倍胞外抗菌物质稀释液处理,其发病率为38.52%,与稀释1500倍的75%三环唑(WP)和稀释500倍的40%稻瘟灵(EC)有显著性差异。活体喷雾接种试验表明,于湘晚籼12号秧苗长至3叶1心时,接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液前24 h喷施稀释100倍的胞外抗菌物质稀释液,其叶瘟防效为75.32%;接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液后24 h喷施稀释100倍的胞外抗菌物质稀释液,其防效为71.49%。【结论】JN005菌株胞外抗菌物质对稻瘟病菌的菌丝生长和孢子萌发有直接抑制作用,且对环境稳定性较好,对稻瘟病有较好的预防和治疗作用,有进一步的开发潜力。     

湖南桃江病圃稻瘟病病菌遗传多样性的SSR分析

为了解湖南桃江病圃稻瘟病病菌遗传多样性,选用14对SSR引物,采用SSR标记技术分析了从该病圃中丽江新团黑谷(广谱高感稻瘟病品种)上分离的89个稻瘟病菌单孢菌株的遗传多样性。结果表明,以相似系数0.72为界,将89个菌株划分成20个遗传谱系,其中L06和L07为优势宗谱,分别含有18和13个菌株,各占总菌株数的20.2%和14.6%;有6个宗谱分别含4~7个菌株,共占总菌株数的34.8%,另12个宗谱分别含菌株1~3个,共占总菌株数的30.3%。该病圃中的稻瘟病菌群体复杂,遗传多样性丰富,湖南抗瘟品种选育和品种布局应针对L06和L07优势宗谱。     

特基拉芽孢杆菌JN-369的分离鉴定及其抑菌物质分析

为筛选可用于防治由稻瘟病菌所致水稻稻瘟病的生防菌株资源，采用稀释涂布平板法，从感病水稻品种湘早籼24号的健康植株茎叶中分离获得了1株拮抗细菌JN-369，结合形态学观察、生理生化鉴定及16S rDNA序列分析对其菌种进行了鉴定，采用平板对峙法研究了JN-369菌株的抑菌谱，并初步测定了JN-369中挥发性有机物 (VOCs)、蛋白类粗提物及脂肽类粗提物对稻瘟病菌的抑制作用。结果表明:JN-369菌株为特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis，其对稻瘟病菌具有显著抑制作用，对菌丝生长的抑制率达80.46% ± 0.83%；同时该菌株对供试的辣椒胶孢炭疽菌、烟草赤星病菌及黄瓜疫病菌等植物病原真菌和卵菌均有抑制作用；但对供试病原细菌则均无抑制作用；1 × 108 cfu/mL 的 JN-369菌悬液产生的挥发性有机物对稻瘟病菌的抑制效果最强，抑制率达72.92% ± 3.01%，1.454 mg/mL的蛋白类提取物和1.026 mg/mL 的脂肽类提取物对稻瘟病菌的抑制率分别为24.68% ± 0.80%和14.34% ± 1.08%。研究表明，菌株JN-369具有一定的开发应用潜力。