犬细小病毒基因型的调查

采用 PCR方法扩增了 13株犬细小病毒 ( canine parvovirus,CPV) VP2基因的 2个片段 ,通过序列测定和 DNAS-tar软件分析 ,结果显示 ,我国的 CPV分离株也存在基因变异现象 ,除发现 CPV- 2、CPV - 2 a、CPV- 2 b突变株外 ,还发现在 CPV- 2 a基础上进一步进化产生的 2个新的变异株。在我国 ,CPV- 2曾在 2 0世纪 80年代早期流行 ,但 1986年后分离到的 CPV以 CPV- 2 a为主 ,在 2 0 0 2年送检的 8份病料中分离到 4株 CPV- 2 a和 4株 CPV- 2 b。PV/貉 / CC/ 1/ 86在CPV- 2 a的基础上 VP2发生氨基酸 30 0 G→ S替换 ,PV/犬 / JL / 1/ 0 2在 CPV- 2 a的基础上 VP2发生氨基酸 5 6 4 S→ N替换 ,其确切的生物学意义尚不清楚。我国的 CPV分离株与参考毒株的核酸同源性超过 98% ,没有形成明显的中国CPV分支 ,进化方式与文献报道的进化方式一致  

传染性法氏囊病超强毒Gx株的致弱研究

本研究成功将鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDVGx株通过SPF鸡胚的快速培育及鸡胚成纤维细胞传代致弱，揭示了vvIBDV从超强毒力向弱毒力转化过程中，其主要结构蛋白VP2基因核苷酸及推导的氨基酸序列的变化规律。对不同代次细胞毒进行了序列分析。发现细胞毒在第7代以前，VP2基因序列没有改变。与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达100%；细胞毒第8代，有个别核苷酸发生了改变。但没有影响氨基酸序列；细胞毒第9代是变化复杂的过渡代；10代毒VP2基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达97%；以后的细胞适应毒至20代。其VP2基因序列不再改变。致病性实验表明原代毒对4周龄SPF鸡致死率为64%。细胞毒第5代的致死率为60%，而20代毒对鸡无致病性。在鸡体内连续传代6代不返强。  

猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达

利用PCR技术从猪细小病毒的RF DNA模板中扩增了含有VP2全基因的2.0kb的基因片段，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，利用双脱氧末端终止法测定了VP2全基因的核苷酸序列。将所得的核心苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较，同源性均在99%以上，从而说明该蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性。将VP2全基因分别克隆入原核表达载体pET15(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成表达质粒pET15bVP2、pET17bVP2和pET28bVP2；将含有VP2基因起始位点至EcoRⅠ切点间的0.8kb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bVP2f。利用上述四种质粒转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况，结果发现pET17bVP2f质粒在45kD处有一特异性表达带，而其它几种质粒均未看到特异性表达带，推测VP2基因3‘端的某些结构可能对VP2全基因的表达有一定影响。这一结果对研究VP2基因的结构与功能具有重要意义。  

含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒的构建

将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因产物插入转移载体质粒pPI-2．EGFP中，构建了含PPV VP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失表达载体质粒pPI-2．EGFP．VP2。采用磷酸钙转染系统，将pPI-2．EGFP．VP2 DNA和PRV DNA共转染Vero细胞后通过直接荧光观察、Dot-blot核酸杂交筛选得到几株重组病毒，将其中一株（命名为SA215-B）DNA用BamHI酶切和Southern转印杂交进一步验证重组病毒构建成功，并通过SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹检测表明PPV VP2基因在重组病毒内获得表达，产生大小约93ku的融合蛋白，同时融合蛋白中的PPV VP2结构蛋白仍然保持了原有的反应原性，表明成功构建了含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒。  

猪细小病毒SY-99株VP2基因的序列分析

克隆并测定猪细小病毒SY－99株VP2基因，与NADL－2（4973）株、NADL－2（5075）株、Kresse株和US－1株VP2基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行比较与分析，发现PPV SY－99株与Kresse株VP2基因核苷酸和氨基酸同一性最高，推测SY－99株可能为一强毒株。  

DNA免疫诱导SPF鸡对传染性法氏囊病的免疫保护反应

传染性法氏囊病病毒（IBDV）D78株VP2基因插入真核表达质粒pCI CMV启动子下游多克隆位点，构成pCIVP2用于3周龄SPF雏鸡DNA免疫。试验鸡每羽腿部肌肉注射pCI VP2 100μg，2周后加强免疫一次；二免2周后，人工感染vvIBDV G株。结果，两次免疫后血清中和抗体试验组为阳性而对照组为阴性；试验组攻毒后发病11／11，攻毒后1周存活10／11，所有存活鸡法氏囊较正常中度或轻度萎缩；对照组发病6／6，病死5／6，存活1／6；存活鸡法氏囊较正常严重萎缩。组织病理学观察表明，无论法氏囊淋巴滤面积还是其中的淋巴细胞数量，免疫试验组都要远远大于或多于免疫对照组。结果表明，VP2基因DNA免疫可诱导SPF鸡产生和中抗体，并形成对IBDV超强株致死攻击的免疫保护，虽不能阻止临床发病及法氏囊病理损伤发生，但有可能减缓法氏囊病理损伤程度。  

猪细小病毒SC-1株VP2基因的克隆及生物信息学分析

根据PPVNADL-2株基因组序列设计了一对引物,以复制型DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.0kb的DNA片段,将其插入克隆载体质粒pUC19,构建重组质粒pPVP2,测序显示PPV-SC-1VP2基因全长1740bp,共编码579个氨基酸。多序列比对结果显示,猪细小病毒VP2基因保守性强,仅存在个别的差异;密码子偏向性分析结果表明,PPV-SC-1VP2基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,并且与PPV-SC-1NS1在密码子的偏向性上具有相同的属性,主要偏向于使用以A结尾的密码子;氨基酸疏水性分析表明,PPV-SC-1VP2蛋白在77~82、291~304、362~373、400~411、465~477等位点存在较明显的亲水区段;跨膜区结构分析显示该蛋白不存在显著意义的跨膜区;分析该蛋白的抗原位点可能位于60~68、81~88、266~275、351~357、398~404位点处。  

鸡传染性腔上囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

为了深入研究鸡传染性腔上囊病病毒（IBDV）VP2基因的结构和功能,利用Bac-to-Bac系统研制出含有VP2基因的重组杆状病毒rBac-VP2,将rBac-VP2感染Sf9细胞,并用抗IBDV VP2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光试验检测,证实感染重组病毒Sf9细胞能高效表达IBDV VP2基因产物;Western-blotting分析结果表明,VP2基因表达产物的分子质量约为40 ku.  

犬细小病毒VP2基因的比较及分型研究

为查明我国CPV的流行变异情况及为进一步的免疫研究奠定基础,对我国不同地区分离到的9株细小病毒毒株进行了VP2基因的扩增和序列分析,并与CPV的参考毒株进行了比较分型, 9 株CPV 中有6 株属CPV 2a,3株属CPV 2b,但未分离到CPV 2c变异株,结果表明我国目前仍以CPV 2a流行为主。  

不同时期8株IBDV地方株VP2基因变异分析

对分离于洛阳地区1991和2001年前后间隔达10年之久的两个时期的8株IBDV进行了VP2基因的克隆与序列分析。结果发现，8个地方株虽均属于IBDV超强毒株，但各个毒株间也有一定的差异。根据它们的核苷酸和氨基酸同源性高低可明显分为3群，分别位于系统进化树上超强毒区的3个小分支上。第1群包括1991年分离的L912、L014和L916三株；第2群包括L913、L017和L018三株；第3群包括2001年分离的L015和L016二株。群内各毒株间同源性较高，在98．3％～100％之间；群间各毒株的同源性则相对较低，在95％～97．9％之间，其中最低的为L015和L017、L016和L018二对，同源性均只有95％。进一步的序列分析表明，8个地方分离株均具有vvIBDV所具有的特征。其中，1991年的4株在各亲水区和七肽区的氨基酸和经典株及传统的超强毒株相比均无明显的变化；而2001年的4个分离株虽仍符合超强毒株的特点，但在相应亲水区均有1～2个氨基酸发生替换，特别是L015和L016株还出现了4个其它各毒株均没有的氨基酸位点变化。