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1.
牛传染性支气管炎病毒PCR诊断方法的研究   总被引:8,自引:1,他引:7  
根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因序列,应用oligo4.1程序设计一对引物PB1/PB2,分别对IBRVLA株、洛精、美精、BarthaNu/67株、B7株、云南-1和云南-2分离株进行PCR扩增。结果显示7株IBR病毒DNA均有399bp的特异性片段。用此引物对其同属的伪狂犬病毒(PRV)、马立克氏病毒(MDV)、鸡传染必喉气管炎病毒(ILTV)进行扩增。均未见特异性条带,证  相似文献
2.
牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株的构建   总被引:8,自引:1,他引:7  
将含有牛传染性鼻气管炎病毒( I B R V) T K 基因的片段克隆于p Bluescript S K 中, 再用 Bg1 Ⅱ和 Sac I切去 T K 基因中347bp 的片段, 获得了含缺失 T K 基因的重组质粒, 然后插入 Lac Z 报告基因, 构建成转移载体。以脂质体转染法将此转移载体与 I B R V Bartha 株在牛肾细胞( M D B K) 上共转染, 经过蓝色蚀斑筛选和蚀斑克隆纯化, 获得了能稳定遗传的重组 I B R V。经 P C R 和 Southern 印迹杂交鉴定, 证实该重组病毒为 T K 基因缺失突变株。  相似文献
3.
牛传染性鼻气管炎病毒gE基因的截短克隆与表达   总被引:6,自引:0,他引:6  
以牛传染性鼻气管炎病毒Baaha Nu/67株的DNA作为模板,用PCR扩增gE基N并克隆至pGEM-T Easy裁体,再以此质粒作为模板将gE基因分成6个片段,分别插入原核表达载体pET32a并在大肠杆菌中进行了表达。蛋白电泳结果表明6个片段中有2个片段以可溶形式表达,1个片段以包涵体形式表达,另外3个片段没有表达。采用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下对两个可溶性片段进行了纯化。经免疫印迹试验,间接ELISA和交叉试验证明,两个纯化的重组蛋白均与牛传染性鼻气管炎阳性血清样品发生反应,而与牛传染性鼻气管炎阴性血清无任何反应,显示其具有良好的抗原性和特异性,可用于牛传染性鼻气管炎gE-ELISA诊断方法的建立。  相似文献
4.
经DNAstar分析,据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)全基因序列设计合成gB基因的特异性引物,以构建的pGM-T-gB为模板,PCR扩增IBRVgB蛋白192-266位氨基酸的基因序列。将目的片段克隆,酶切鉴定并测序鉴定后,定向插入pET32a表达载体中,转化表达菌BL21。SDS-PAGE电泳分析表明,诱导表达产物以包涵体和可溶形式存在,大小约为29.2ku,与预测值相符。亲和纯化后重组蛋白浓度为2.000mg/mL,纯度为79.2%。间接ELISA检测证明,表达蛋白具有抗原性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了间接ELISA诊断方法。确定的抗原包被浓度为50/zg/mL,血清的最佳稀释度为1:40,阳性标准定为s/e〉0.395。交叉试验表明对牛流热(BEV)、牛肺疫(CBPP)、牛病毒性腹泻(BVD)、牛结核(BTB)、牛副结核(PBB)以及牛赤羽病(BAD)等其它6种疾病阳性血清不发生交叉反应。与中和试验相比较,特异性、敏感性和符合率分别为83.3%、90.9%和88.9%;与进口法国IBRV全病毒ELISA抗体诊断试剂盒比较,特异性、敏感性和符合率分别为92%、92.7%和92.5%。上述结果表明该诊断方法具有良好的特异性和敏感性,显示了良好的应用前景。  相似文献
5.
牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白研究进展   总被引:3,自引:0,他引:3  
牛传染性鼻气管炎病毒能引起牛多系统感染,是导致养牛业重大经济损失的一种重要病原。该病毒是有囊膜的双股DNA病毒,病毒囊膜蛋白在病毒致病中发挥了重要作用,其中gB蛋白对病毒的吸附、侵入、复制和细胞间扩散是必需的,可刺激机体产生大量的中和抗体。对gB蛋白的研究不仅是理解病毒分子生物学功能特征的需要,而且在临床诊断和疾病预防中也具有重要意义。文章就gB蛋白的结构特征、生物学功能以及在免疫学和诊断方面的研究做了综述,并对上述方面进行了展望。  相似文献
6.
牛传染性鼻气管炎病毒攻毒方式的对比研究   总被引:2,自引:1,他引:1       下载免费PDF全文
本试验旨在建立牛传染性鼻气管炎病毒的攻毒模型,明确病毒在牛体内的分布及确定最佳攻毒方式,建立牛传染性鼻气管炎的发病标准,用来评价IBRV LNM弱毒疫苗的保护效力。试验共使用健康断乳牛9头,设鼻内喷雾组、滴鼻组和对照共3组,每组3头牛。将实验室分离保存的IBRV LN01/08强毒株采用鼻内喷雾和滴鼻两种方式接种试验组动物后,连续14 d,每日观察临床症状,监测体温及采集鼻拭子,对收集的试验数据进行对比分析。选取临床发病不同时期剖杀动物,采取主要脏器进行病毒分离。结果显示,所有动物攻毒后有不同程度的临床表现,以鼻内喷雾组临床表现最为严重,剖检可见肺部病变明显。病毒主要分布在呼吸道和眼结膜组织中。研究结果显示,采用IBRV自然感染方式攻击动物,喷雾方法攻毒临床效果明显强于滴鼻方式,保证了临床发病模型的建立,可以用来IBRV疫苗免疫效果评价,为研制IBR疫苗提供前提基础。  相似文献
7.
奶牛传染性鼻气管炎病毒gG基因PCR检测方法的建立   总被引:2,自引:1,他引:1       下载免费PDF全文
本试验旨在建立一种PCR技术,既能快速检测牛传染性鼻气管炎病毒,又能区分同属病毒牛疱疹病毒5型和伪狂犬病病毒。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒gG基因的特异性引物,建立PCR方法,对牛传染性鼻气管炎病毒参考毒株和阳性样本进行扩增,结果均能扩增出一条463 bp的特异性条带;对同属的牛疱疹病毒5型进行扩增,获得651 bp和431 bp两条带;对同属伪狂犬病病毒进行扩增,获得493 bp的条带;而非相关病毒(如猪呼吸与繁殖综合征病毒等),不能扩增出条带。对牛传染性鼻气管炎病毒的检测灵敏度为2×10-3 PFU/mL。鉴于该方法具有良好的灵敏度和特异性,将在牛疱疹病毒感染诊断和标记疫苗免疫后的鉴别诊断方面具有良好的应用前景。  相似文献
8.
牛传染性鼻气管炎病毒tk基因的克隆   总被引:2,自引:0,他引:2  
王柳  于力 《中国兽医学报》1995,15(2):116-120
根据牛传染性鼻气管炎病毒LA株的物理图谱及Coper株和LA标tk基因在基因组中的定位,将LA株DNA HindⅢA片段中的SalI-SalI亚片段、BglⅢ-SalI双酶切亚片段分别克隆到载体质粒pBluescriptSK中,筛选出3个重组质粒p^tk-1,Ptk-2和Ptk-3,其外源片段大小分别为2.7kb,1.1kb和1.6kb。经酶切分析及同源核酸探针杂交试验表明,2.7kb SalI-  相似文献
9.
牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立   总被引:1,自引:1,他引:3  
根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)保守基因gB和gE序列,分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释的病毒进行扩增以检测其灵敏度,同时对伪狂犬病病毒(PRV)、马立克病病毒(MDV)、鸭瘟病毒(DPV)进行特异性检测.结果显示,建立的扩增gB和gE基因的荧光PCR可用于检测IBRV,其灵敏度为0.02 TCID50,而与PRV等非IBRV无交叉反应.本研究所建立的荧光PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可用于IBRV的检测.  相似文献
10.
牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的截短表达与活性检测   总被引:1,自引:1,他引:0  
经生物学软件DNAStar分析,以牛传染性鼻气管炎病毒(Banha Nu/67)基因组DNA为模板,PCR扩增gD基因943bp的片段,将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到部分可溶表达的重组蛋白。用Ni柱亲和层析法在非变性的条件下纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.852mg/mL,纯度为85.2%。Westem blot、间接ELISA检测证明纯化的重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。  相似文献
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