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1.
天然鼠源噬菌体单链抗体库的构建   总被引:3,自引:0,他引:3  
噬菌体展示技术是一项利用丝状噬菌体体外表达外源基因的新技术。它模拟动物体内抗体的形成过程,将抗体片段呈现在噬菌体表面,建成噬菌体抗体库,用与亲和层析相类似的原理,从抗体库中筛选出特异性噬菌体抗体,为制备人和动物用抗体提供了极为有效的手段。单链抗体是利用基因工程技术,由一个DNA片段(Linker)将抗体重链、  相似文献
2.
噬菌体抗体库技术研究进展   总被引:2,自引:0,他引:2  
噬菌体抗体库技术是利用PCR扩增出抗体的全套可变区基因,将抗体分子DNA片断如Fab或单链抗体(ScFv)与噬菌体外壳蛋白基因PⅢ或PVⅢ连接,使融合蛋白表达于噬菌体颗粒的表面,经过“吸附-洗脱-扩增”过程富集筛选特异性抗体。这一技术将抗体基因型和表型联系在一起,使识别抗原的能力和噬菌体的可扩增性统一起来,较好的模拟了体内的抗体产生的过程,成为一种高效的筛选体系。本文就噬菌体抗体库技术的原理、构建、筛选及其应用研究进展做一综述。  相似文献
3.
抗庆大霉素噬菌体抗体库的构建和筛选   总被引:1,自引:1,他引:0       下载免费PDF全文
本研究使用噬菌体抗体库技术筛选针对庆大霉素(gentamicin)的单链抗体。以抗庆大霉素杂交瘤细胞株(2A3)为基因来源构建scFv基因,连接至pCANTAB5E噬菌粒载体,通过电击转化TG1(Escherichia coli TG1)构建了库容量为6.5×106噬菌体单链抗体库。抗庆大霉素噬菌体单链抗体库进行三轮富集筛选,通过Phage-ELISA技术成功筛选出了9个抗庆大霉素噬菌体阳性克隆,为开发新型残留检测用抗体奠定了基础。  相似文献
4.
为探索治疗禽流感的方法,本实验从免疫H5N1亚型禽流感疫苗的猕猴淋巴细胞中提取总mRNA并扩增重链和轻链可变区(VH、Vλ和Vκ),用重叠延伸PCR方法构建VH-Linker-Vλ和VH-Linker-Vκ形式的单链抗体(scFv),采用噬菌体展示技术构建了噬菌体抗体库,从2.2×106的噬菌体库中淘选得到具有较高亲和力的H6株scFv,并通过ELISA、SDS-PAGE、western blot、间接免疫荧光(IFA)和竞争抑制ELISA对其进行鉴定,证实所获得的scFv为32 ku,并且能与病毒发生特异性结合.IgBlast序列分析发现,所得到的scFv基因Vλ与人免疫球蛋白胚系基因同源性达91.5%,而VH同源性为75%.本研究所得到的猴源抗体可变区为人源化抗体的构建以及禽流感的治疗奠定了基础.  相似文献
5.
旨在研究血清学检测的雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体的特异性。以从噬菌体Fab抗体库中筛选到具有较高雄性特异性结合活性的重组噬菌体克隆为基础,构建Fab抗体的可溶性表达噬质粒,并诱导和纯化该抗体片段,利用免疫荧光FITC/DAPI共染技术和ELISA分析其特异性。结果表明,该抗体在约49 ku处有条带出现。在Fab抗体和H-Y抗血清的细胞免疫荧光比较分析试验中发现,从雌、雄鼠脾细胞的阳性细胞数量和平均荧光强度的角度分析,Fab抗体的雄性特异性强于抗血清。石蜡切片免疫荧光定量分析显示,Fab抗体与雄鼠肝脏的结合活性明显高于对应雌鼠,差异极显著(t=20.73,P=0.002 3<0.01),而H-Y抗血清与雄鼠肝脏的结合活性略高于对应雌鼠,差异显著(t=7.11,P=0.019 2<0.05)。以C57BL/6雄鼠脾细胞、睾丸细胞作为抗原的ELISA分析显示,Fab抗体具有雄性特异性,但Fab抗体的OD值低于抗血清。结果提示,Fab抗体的雄性特异性高于H-Y抗血清,但其雄性特异性结合活性低于H-Y抗血清,Fab抗体在具备雄性特异性的同时,仍有少量雌性非特异性结合,Fab抗体的体外亲和力成熟可作为后续研究工作,以获...  相似文献
6.
为了构建重组猪蛔虫抗原AD41蛋白鼠源性单链抗体库,试验用重组蛋白AD41抗原免疫接种Balb/c小鼠,提取小鼠脾脏总RNA,以总RNA为模板经RT-PCR合成cDNA,再以cDNA为模板,用小鼠免疫球蛋白重链和轻链设计引物,分别扩增重链和轻链可变区基因,利用SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成单链抗体(ScFv)片段,将其克隆入质粒表达载体pCANTAB5E中,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07援救构建噬菌体单链抗体库。结果表明:从30个噬菌体克隆中筛选到25个阳性克隆。说明成功地构建了抗重组猪蛔虫抗原AD41蛋白鼠源性单链抗体库。  相似文献
7.
利用雄鼠脾细胞免疫6~7周龄C57BL/6雌鼠,加强免疫后取脾细胞,TRIZOL法提取细胞总RNA,并逆转录合成cDNA第一条链。以其为模板,利用特异性Ig基因的引物PCR扩增出重链Fd片段和κ链基因,并将扩增出基因重组到噬质粒载体pComb3中,重组噬质粒转化大肠杆菌XL1-Blue中,分别构建κ链基因库和抗体Fab段基因库。分别经蓝白斑筛选,计算转化效率,通过PCR反应和双酶切反应鉴定抗体库的重组率,轻链、重链Fd段基因的重组率均为80%。抗体Fab段基因库经过辅助噬菌体VCSM13超感染,成功构建了鼠源性噬菌体Fab抗体库,并测定噬菌体抗体库的库容和滴度,结果分别为1.5×107,3.2×1011pfu/mL。对噬菌体抗体库的18个克隆进行ELISA分析,结果显示以雄鼠脾细胞作为抗原时,有9个克隆含有雄性特异性的噬菌体抗体,而以雄鼠睾丸细胞作为抗原时,有8个克隆与睾丸细胞呈现结合活性。噬菌体抗体库的构建为雄性特异性抗原的鼠源性噬菌体抗体Fab片段的筛选及其应用、雄性特异性抗原和抗体功能性分子基础的研究奠定了坚实基础。  相似文献
8.
Antibodies cross‐reacting with homologue antigens in different species would be essential reagents for the development of comparative oncology studies. In comparison with conventional immunoglobulin Gs, recombinant nanobodies (single‐domain variable regions of heavy‐chain only antibodies of Camelidae origin) can be easily isolated in vitro and engineered into a variety of reagents with optimized characteristics for different research and clinical applications. We recovered an anti‐human epidermal growth factor receptor 2 (anti‐HER2) nanobody from a naïve llama library by direct panning on whole cells and expressed it fused to Fc and green fluorescent protein. These immunoreagents were assessed by flow cytometry and immunofluorescence with both human and canine cells overexpressing HER2 and its canine homologue dog epidermal growth factor receptor 2. The reported data illustrate the potential of using this class of antibodies in comparative oncology and suggest some development perspectives enabled by in vitro panning of pre‐immune nanobody libraries.  相似文献
9.
本研究应用噬菌体抗体库技术筛选禽流感亚型病毒Fab抗体,并建立相应ELISA检测方法。用禽流感亚型混合疫苗免疫小鼠,取其脾脏提取总RNA用于扩增免疫球蛋白轻链和重链基因,克隆至噬菌粒pComb3,然后转化入感受态细胞XL1-Blue中,以1012 CFU辅助噬菌体VCSM13进行感染后,获得Fab抗体库容量为8×107 CFU。以H5N1病毒为抗原进行4轮亲和筛选,获得特异性结合的克隆,利用获得的特异性克隆进行ELISA检测方法的建立。  相似文献
10.
构建鼠源性抗日本血吸虫噬菌体抗体文库 ,以探索制备抗日本血吸虫单克隆抗体的新方法。用文库构建试剂盒 ,以感染小鼠脾脏为材料 ,建立了抗日本血吸虫噬菌体抗体文库 ,并对该抗体库进行了富集、筛选和鉴定。构建的噬菌体抗体库库容为 1 .0 7× 1 0 6 ;从抗体库随机挑取的 72个克隆中最终筛选到特异性抗日本血吸虫阳性克隆 2个。 SDS-PAGE和 Western blot-ting分析结果显示 :两个克隆表达的单链抗体大小均为 3 .1万 ,且具有良好的特异性。日本血吸虫噬菌体抗体库的成功建立为进一步的应用奠定了基础  相似文献
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