基于高通量测序的技术检测梨树病毒

【目的】 研究运用基于高通量测序的技术检测梨树病毒,为梨树病毒的检测提供新方法。【方法】 于2014年、2017年、2018年4月中旬采集库尔勒香梨花朵若干,分别进行转录组测序,将得到的序列经过转录本拼接、层次聚类和基因功能注释,筛选出注释为植物病毒的序列作为候选病毒序列。利用RT-PCR方法检测随机采集的香梨枝条样品,验证高通量测序结果的可靠性。【结果】 根据3组转录组测序数据的生物信息学分析结果,分别对注释为来源于植物病毒的66、202和921条基因序列进行分析。3种梨树中已报道的病毒,分别是苹果茎痘病毒、苹果茎沟病毒和苹果褪绿叶斑病毒,以及梨树中未报道的芸薹黄化病毒。采用设计的特异性引物,通过RT-PCR技术对筛选出的4种病毒进行扩增验证,结果扩增出苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒的目的片段。【结论】 高通量测序技术可作为检测梨树病毒的一种快速、有效手段。     

四川地区猕猴桃病毒1的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

为了明确近期新西兰报道的侵染猕猴桃的新病毒——猕猴桃病毒1（Actinidia virus 1，AcV-1）在四川地区猕猴桃上的发生情况及其分子特性，采用RT-PCR对来自四川6个地区疑似感染病毒的90份猕猴桃主栽品种‘红阳’和‘金果’的叶片样品进行检测。结果表明，22份样品为AcV-1阳性，检出率为24.4%。将获得的5个AcV-1分离物和已报道的新西兰分离物K75的外壳蛋白（coat protein，CP）基因序列进行比对，结果表明，分离物间核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为84.8% ~ 97.1%和89.7% ~ 99.6%，其中除邛崃分离物HYH5与新西兰分离物K75的核苷酸序列相似性较高（97.1%）外，其余4个分离物均低于91%。系统进化分析结果显示，这些分离物主要聚集在3个分支上，分离物HYH5与新西兰分离物K75位于同一分支，其余分离物位于另外2个分支。     

苹果花脸病田间病情发展及ASSVd在组培条件下的传播

为了明确苹果锈果类病毒（apple scar skin viroid，ASSVd）引起的苹果花脸病在田间的病情发展情况以及ASSVd在组培条件下的传播方式，2012—2015年对河北省顺平南神南村3个果园进行持续调查和检测。结果显示，果园A、B、C的显症率分别从3.00%、19.35%和10.00%上升至10.00%、34.41%和22.00%，带毒率分别从11.00%、20.43%和14.00%上升至23.00%、37.63%和30.00%，带毒率和显症率都逐年增加，而且带毒率大于显症率，即有些带毒果树不显症。发病果树田间分布有明显的发病中心。通过高通量测序发现显症果树ASSVd vsiRNA reads数是带毒未显症reads数的4.08倍，同时实时荧光定量PCR检测发现显症树ASSVd病毒积累量显著高于带毒未显症树。以携带ASSVd的组培苗和无毒组培苗为试材，利用RT-PCR检测明确了ASSVd可通过伤口沾染带毒汁液、组培剪污染、含毒培养基、根系接触进行传播，其中根系接触传染率较高。     

应用巢式RT-PCR检测水仙退化病毒1

水仙退化病毒（Narcissus degeneration virus，NDV）是水仙上发生较为严重的病毒之一。本文根据 NDV 已报道的外壳蛋白基因序列，设计特异性引物，以感病水仙的总 RNA 为模板，建立了快速检测 NDV 的巢式 RT-PCR 方法。结果表明，巢式 RT-PCR 具有良好的特异性和灵敏度，能够从感染 NDV 的水仙样品上扩增出与预期大小相符的特异性目的条带，同时与其他病毒无交叉反应；灵敏度测定结果表示，巢式 RT-PCR 灵敏度较高，是普通 RT-PCR 的104倍，当 RNA 稀释到109倍时仍能被检测到。本文建立的巢式 RT-PCR 为水仙上 NDV 的快速检测提供了技术参考依据。     

葡萄卷叶伴随病毒1号和3号宁夏分离物部分基因序列分析

为明确葡萄卷叶伴随病毒(GLRaVs)在宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄上的侵染状况,采用RT-PCR技术对40份酿酒葡萄样品中的GLRaV-1~GLRaV-5进行了外壳蛋白(CP)、复制酶(RdRp)和热激蛋白(HSP70)基因序列的克隆和分析。检测结果表明,在所检测的5种病毒中,除GLRaV-2和GLRaV-4未检测到外,GLRaV-1和GLRaV-3的检出率最高,分别为20.0%和32.5%,GLRaV-5的检出率仅为5.0%;有6个样品存在GLRaV-1和GLRaV-3两种病毒复合侵染。序列分析表明,GLRaV-1宁夏分离物的部分CP基因序列长度为232nt,其两种分离物间的核苷酸序列同源率为90%,与已报道的国内外其他分离物CP基因序列相比,其同源率为90%~99%;GLRaV-3宁夏分离物的CP基因序列长度为942nt,其两种分离物间的核苷酸序列同源率为40%,与已报道的国内外其他分离物CP基因序列相比,其同源率为40%~99%;GLRaV-3宁夏分离物的RdRp基因序列长度为683nt,其各分离物间的核苷酸序列同源率为90%以上,与已报道的国内外其他分离物RdRp基因序列相比,其同源率为90%~99%;GLRaV-3宁夏分离物的HSP70基因序列长度为546nt,其两种分离物间的核苷酸序列同源率为96%,与已报道的国内外其他分离物HSP70基因序列相比,其同源率为96%~99%。     

柑橘脉突病毒基因组全长cDNA克隆及其侵染性鉴定

【目的】构建柑橘脉突病毒（citrus vein enation virus,CVEV）侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】利用SMARTer^? RACE(rapid amplification of cDNA ends)试剂盒对CVEV的5′序列进行RACE,并依据序列分析结果及CVEV分离株VE-1保守序列,设计CVEV基因组全长cDNA扩增引物。以CVEV毒源植株的总RNA为模板,通过EV25-F/EV5983-R引物扩增CVEV基因组全长cDNA。利用In-Fusion重组连接线性化pXT1和CVEV全长cDNA。通过菌液PCR及测序分析鉴定CVEV基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导的真空浸润接种摩洛哥酸橙（Citrus aurantium）、邓肯葡萄柚（C. paradisi）、尤力克柠檬（C.limon）、枳柚（C. paradisi×Poncirus trifoliata)、Rusk枳橙（P. trifoliata×C. sinensis）、枣阳小叶枳(P. trifoliata),进一步通过RT-PCR检测、症状观察鉴定所构建CVEV全长cDNA克隆的侵染性。【结果】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得基于双元载体pXT1的CVEV基因组全长cDNA克隆10个。随机选取的6个全长cDNA克隆CVEV1901—CVEV1906的序列一致性为99.35%。其中,CVEV1901基因组全长5 983 nt,由5个开放阅读框、5′端207 nt和3′端198 nt的两个非翻译区、以及ORF2和ORF3之间122 nt的基因间隔区组成。序列分析结果显示,CVEV1901与浙江分离株XZG及四川SM分离株的序列一致性分别为99.98%和99.11%;与西班牙VE-1分离株、美国加州VE701分离株和日本IBK分离株基因组序列一致性在96.89%—98.61%;与同属中豌豆耳突花叶病毒（pea enation mosaic virus）和紫花苜蓿耳突病毒（alfalfa enamovirus）的序列一致性约90%。通过农杆菌介导的真空浸润将CVEV1901接种至6个不同的柑橘品种,接种后120 d的RT-PCR检测结果表明摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚、尤力克柠檬、枳柚、Rusk枳橙和枣阳小叶枳阳性植株/接种植株（阳性率）分别为16/17（94.12%）、12/14（85.71%）、16/21（76.19%）、15/19（78.95%）、13/14（92.86%）和0/18（0）。其中,部分摩洛哥酸橙出现典型CVEV侵染症状,叶片侧脉和支脉产生耳状小突起,叶背有相应的凹陷;部分邓肯葡萄柚和尤力克柠檬出现叶片皱缩现象。【结论】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得了CVEV基因组全长cDNA侵染性克隆,通过农杆菌介导的真空浸润接种可引起摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚和尤力克柠檬的CVEV侵染症状。     

甘肃省18种药用植物病毒病调查及2种病毒病的鉴定

2012年6月至2013年9月对甘肃省宕昌县、漳县、岷县、渭源县、陇西县、临洮县等地区种植的具有疑似病毒病症状的半夏等18种药用植物进行调查及采样。采用黄瓜花叶病毒(CMV)、苜蓿花叶病毒(AMV)、烟草花叶病毒(TMV)、番茄花叶病毒(ToMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、芜菁花叶病毒(TuMV)等7种双抗体夹心免疫酶联检测(DAS-ELISA)试剂盒初检, 并对CMV和ToMV采用反转录PCR(RT-PCR)方法复检, 结果表明, 半夏、掌叶大黄和红花3种药用植物受到黄瓜花叶病毒(CMV)侵染; 马兜铃、土贝母及当归3种植物受到番茄花叶病毒(ToMV)侵染; 样品中未检测到上述其他病毒种类, 其余12种病毒样品的病原尚未确定。本研究为国内首次报道CMV病毒侵染掌叶大黄、红花, ToMV病毒侵染马兜铃、当归和土贝母。此研究为防治上述病毒病提供了依据。     

荧光定量PCR法检测点带石斑鱼神经坏死病毒研究

根据己公布的神经坏死病毒全基因序列,应用引物设计软件依据Gene Bank所收录的各种石斑鱼神经坏死病毒RNA2基因组全序列选择保守区域,根据Taqman探针引物设计原则,设计Taq Man探针及其引物。采用Taq Man探针技术,并且将假病毒技术构建的含有神经坏死病毒RNA2基因组的MS2噬菌体假病毒作为阳性质控品,建立Taq Man探针检测点带石斑鱼神经坏死病毒的荧光定量PCR方法,拟合标准曲线,能够在病毒检测中进行绝对定量,能检测到10个病毒拷贝模板数,在临床检测中得到很好运用。本研究建立实时荧光定量RT-PCR,有助于日常检验工作,为鱼类神经坏死病毒的筛选和监测提供基础,有助于控制神经坏死病的疫情传播。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性/经典毒株多重RT-PCR方法的建立及应用

为了建立鉴别猪瘟病毒(Classical swine virus,CSFV)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)及经典猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)的快速检测方法,根据GenBank中公布的已知序列,设计合成了针对CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV特异性引物。经过引物筛选及对退火温度、引物比例等扩增条件的优化,建立了用2对引物同时检测CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV的多重RT-PCR方法。该方法可同时扩增出287bp的CSFV、374bp的HP-PRRSV和464bp的C-PRRSV目的核苷酸片段,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)等无交叉反应,最低可以检测到11.3pg的CSFV、4.7pg的HP-PRRSV和2.8pg的C-PRRSV总RNA。分别用多重和单项RT-PCR检测了从河北省采集的31份血清或组织样品,其中CSFV、HP-PRRSV、C-PRRSV以及CSFV与HP-PRRSV混合感染的检出率分别为19.4%、22.6%、0%与9.7%,多重与单项RT-PCR的符合率为100%。本试验建立的多重RT-PCR方法可同时鉴别CSFV、HP-PRRSV与C-PRRSV,适于猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测与流行病学调查。     

青稞叶绿体基因RNA编辑位点的预测、鉴定与比较分析

为了阐明青稞叶绿体基因组RNA编辑位点的组成与特性,首先利用生物信息工具对青稞叶绿体基因的RNA编辑位点进行了预测,结果发现了35个分布于15个基因的编辑位点,所有编辑均为C到U的转换,其中基因ndhB包含的编辑位点数量最多,达9个,这与其他麦类作物相似;进一步利用RT-PCR结合克隆测序,对预测的35个位点进行了实验验证,发现18个编辑位点被证实发生了C到U的编辑;对编辑前后编码蛋白质的结构进行了比较分析,发现RNA编辑引起了编码蛋白的结构变化,暗示RNA编辑可以造成编码蛋白功能的改变。最后,将青稞叶绿体基因RNA编辑位点与栽培大麦、野生大麦的叶绿体RNA编辑位点进行了比较,发现青稞与栽培大麦的RNA编辑组成完全一样,而野生大麦缺失了 ndhA-563位点,初步印证了大麦的起源进化关系。