青花菜P450CYP79F1全长克隆、表达及其与不同器官中莱菔硫烷含量的相关性分析

【目的】克隆青花菜细胞色素家族P450CYP79F1,分析其序列特征,阐明其在不同发育时期器官中的表达情况及其与莱菔硫烷含量的关系,为进一步揭示莱菔硫烷合成机理提供科学依据,为青花菜品种改良和新品种选育奠定基础。【方法】通过5′和3′端RACE克隆技术获得青花菜CYP79F1全长序列,利用DNAMAN 6.0进行基因拼接、氨基酸序列分析和蛋白二级结构预测,结合在线分析程序和软件进行基因和编码蛋白生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术研究CYP79F1在不同发育器官中的表达情况;结合HPLC方法测定各相应时期器官中莱菔硫烷含量,包括青花菜发育时期的根、茎、叶,成熟花球,抽薹期花蕾(顶端蕾、成熟蕾、开花前1 d的蕾和花)和种子;对CYP79F1表达量与和莱菔硫烷含量进行相关性分析。【结果】获得了CYP79F1全长序列,Gen Bank登录号为MG012890,该基因全长2 014 bp,包含一个1 620 bp的开放读码框(ORF),编码540个氨基酸;编码的蛋白与甘蓝、白菜、芥蓝和油菜等同源蛋白的相似性均在95%以上;生物信息学分析表明该基因编码的酶蛋白有2个信号肽和2个跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质中;CYP79F1在根和茎中的表达量较高,叶中表达量最低,在花器官发育时期,自顶端蕾到花发育过程中呈现逐渐降低的表达趋势,种子中该基因表达量与花处于同一水平。Pearson相关性分析显示,青花菜发育时期的根、茎、叶、成熟花球、抽薹期花蕾和种子中莱菔硫烷含量与CYP79F1表达量无显著相关关系,但抽薹期花蕾自顶端花蕾到花中莱菔硫烷生成量与CYP79F1表达量呈显著正相关关系(R=0.96,P0.05),CYP79F1在调控莱菔硫烷的生成方面起重要作用,尤其是在生殖器官花蕾的发育过程中,能够显著上调莱菔硫烷的生成量。【结论】CYP79F1在青花菜不同发育器官中对莱菔硫烷的生成发挥着重要调控作用,可能与青花菜不同器官中莱菔硫烷含量多样性密切相关。     

二化螟两种P450基因CYP4M38和CYP4M39的时空表达分析

细胞色素P450在昆虫对外源物质代谢中发挥重要作用,是昆虫重要的解毒酶系。CYP4家族是昆虫细胞色素P450基因家族中的重要分支,与昆虫的解毒代谢密切相关。为初步明确CYP4家族基因在二化螟中的表达信息,本文测定分析了二化螟两种P450基因CsCYP4M38和CsCYP4M39的序列同源性及时空表达谱,序列同源性分析发现CsCYP4M38与烟草天蛾MsCYP4M2氨基酸序列同源性最高,序列一致性高达56.86%;CsCYP4M39与烟草天蛾MsCYP4M1氨基酸序列同源性最高,序列一致性高达59.96%,构建系统发育树显示,CsCYP4M38与CsCYP4M39属于CYP4家族,且分别与MsCYP4M2和MsCYP4M1进化距离较近;时空表达谱测定结果表明,两种基因在不同发育阶段和不同组织中的表达存在差异性,CsCYP4M38在2龄幼虫、5龄幼虫及雌成虫内表达量相对较高,在1龄幼虫中表达量最低,CsCYP4M39在幼虫期表达量相对较高,且表达量随龄期增加呈现先上升后下降的趋势,在卵、蛹及成虫中表达量相对较低。CsCYP4M38和CsCYP4M39在脂肪体、中肠及表皮中的表达量相对较高,且均在脂肪体内的表达量最高。明确基因表达谱是研究其功能的基础,CsCYP4M38和CsCYP4M39在不同阶段的表达量具有一定的变化性,说明这两种基因在二化螟不同发育历期中的功能不同,而两种基因均在脂肪体中表达量最高,这可能与脂肪体是昆虫的主要的解毒代谢场所有关。     

黏虫CYP9A113基因的克隆及外源物质对基因表达的诱导效应

黏虫是我国作物上最重要的害虫之一。细胞色素P450能够参与昆虫外源物质代谢。本研究采用RACE技术克隆了一条编码黏虫P450基因的cDNA序列,并通过Real-time PCR技术,检测了4种外源物质对该基因表达的诱导效应。该基因被国际P450命名委员会命名为CYP9A113,GenBank登录号为KY436739。利用2.5%高效氯氟氰菊酯乳油的LD_(50)处理黏虫3 h,LD_(10)、LD_(30)和LD_(50)处理12 h和24 h,可诱导表达CYP9A113基因;20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂的LD_(10)处理黏虫12、24和48 h,LD_(30)和LD_(50)处理24 h,CYP9A113基因表达呈诱导效应;0.1和0.5 mg/mL香豆素处理6、12、24和48 h,CYP9A113基因表达均呈诱导效应;0.1和0.5 mg/mL吲哚-3-甲醇处理3、6、12、24和48 h,CYP9A113基因表达均呈诱导效应。     

杂草对除草剂非靶标抗性机理研究进展

随着除草剂的大面积持续使用,近年来抗性杂草种类增多,危害面积不断增加,危害程度逐渐加重。杂草对除草剂抗性问题业已成为威胁全球粮食安全的关键问题之一。杂草对除草剂的抗药机制主要分为靶标抗性和非靶标抗性,非靶标抗性主要包括对除草剂解毒能力增强、屏蔽作用或与作用位点的隔离作用等机理。本文主要对除草剂的非靶标抗性机制中的P450s、GSTs、ABC转运蛋白和谷胱甘肽转运体等进行综述,并对非靶标抗性机制研究前景进行展望。     

基于转录组测序技术分析吡虫啉或氟啶虫胺腈对麦二叉蚜细胞色素P450基因表达的影响

为了筛选出麦二叉蚜Schizaphis graminum 参与吡虫啉或氟啶虫胺腈代谢调节的细胞色素P450(P450) 基因，采用浸渍法，用吡虫啉或氟啶虫胺腈处理麦二叉蚜24 h后，通过构建转录组测序文库，并进行RNA-seq测序，筛选出差异性表达的P450基因，并进行实时荧光定量PCR(qPCR) 验证。结果表明:用吡虫啉处理麦二叉蚜后，有19个P450基因上调表达，15个P450基因下调表达；用氟啶虫胺腈处理麦二叉蚜后，有18个P450基因上调表达，15个P450基因下调表达。运用qPCR验证了吡虫啉对12个P450基因的诱导表达，其结果与DGE测序文库显示的结果基本一致。这些结果可为深入研究麦二叉蚜P450对蚍虫啉和氟啶虫胺腈的解毒代谢作用提供依据。