2018年中国部分地区猪瘟病毒2.1d亚型新流行株的基因组特征分析

为了解中国猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）的分子流行病学及遗传变异情况，本研究应用RT-PCR方法对2018年采集自河南、河北、山东、黑龙江和辽宁5个省份的350份疑似CSFV感染的病料进行E2和NS5B基因扩增，并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示，350份样品中21份为CSFV阳性，共获得14株CSFV的E2基因序列和7株CSFV的部分NS5B基因序列。E2全基因、NS5B部分基因序列分析表明，21份阳性样品均属于近年来在中国流行的CSFV 2.1d亚型，且新发现的2.1d亚型CSFV与中国较早2.1d亚型CSFV毒株间同源性差异不大，新发现的2.1d亚型CSFV分离株在E2基因的6个氨基酸（R³¹、S³⁴、W¹⁸²、K²⁰⁵、K³⁰³、A³³¹）上具有相同的分子特征，E2蛋白中15个位点上的半胱氨酸均未发生变异。韩国2.1d亚型CSFV在E2蛋白上具有3个独特的氨基酸（N⁹⁷、K¹⁵⁹、R²⁰⁵）特征，并且发现了韩国毒株YC11WB可能作为2.1b和2.1d亚型CSFV过渡毒株的证据，流行于中国和韩国的2.1d亚型CSFV可能分别来自于本国早期2.1b亚型CSFV的衍化。本研究证实，2018年中国及周边国家CSFV较为活跃，且流行毒株依然以2.1d亚型为主，为中国科学防控CSFV提供了依据。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性/经典毒株多重RT-PCR方法的建立及应用

为了建立鉴别猪瘟病毒(Classical swine virus,CSFV)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)及经典猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)的快速检测方法,根据GenBank中公布的已知序列,设计合成了针对CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV特异性引物。经过引物筛选及对退火温度、引物比例等扩增条件的优化,建立了用2对引物同时检测CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV的多重RT-PCR方法。该方法可同时扩增出287bp的CSFV、374bp的HP-PRRSV和464bp的C-PRRSV目的核苷酸片段,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)等无交叉反应,最低可以检测到11.3pg的CSFV、4.7pg的HP-PRRSV和2.8pg的C-PRRSV总RNA。分别用多重和单项RT-PCR检测了从河北省采集的31份血清或组织样品,其中CSFV、HP-PRRSV、C-PRRSV以及CSFV与HP-PRRSV混合感染的检出率分别为19.4%、22.6%、0%与9.7%,多重与单项RT-PCR的符合率为100%。本试验建立的多重RT-PCR方法可同时鉴别CSFV、HP-PRRSV与C-PRRSV,适于猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测与流行病学调查。     

猪瘟病毒DNA疫苗的构建及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒（CSFV） C株E2囊膜蛋白全长基因克隆到真核表达载体pcDNA4.0的CMV启动子下游，采用磷酸钙转染法将重组质粒转入293T细胞，流式细胞仪(FACS)检测293T细胞瞬时表达了E2囊膜蛋白。将构建的重组质粒肌肉注射BALB/c小鼠，用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测证明成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体，为下一步利用DNA疫苗免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

采用单克隆抗体制备技术,建立了分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,液氮保存4年后复苏,细胞在HAT选择培养基中生长旺盛,分泌抗体稳定,分别命名为YNF1,YNF2,YNF3,YNF4,杂交瘤细胞染色体数介于96~115条。细胞培养上清和腹水的单抗间接ELISA效价分别为1∶80~1∶160和1∶5 000~1∶10 000。在间接ELISA和夹心ELISA检测中单抗与猪瘟病毒呈特异性反应,与正常的猪、兔肾组织提取液及其血清Ig无交叉。抗体蛋白属IgG类,亚类及轻链分别为IgG1/λ,IgG2a/κ,IgG2a/λ,IgG1/λ。结果表明,4株杂交瘤是分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的细胞株,可长期传代无限分泌单抗,是进一步研究猪瘟病毒和开发敏感、特异、快速诊断猪瘟试剂盒和试纸探针的免疫学特异性试剂来源。     

规模猪场4大疫病的血清学检测及免疫抑制病因分析

选取杭州、绍兴、嘉兴和湖州4个地区的规模猪场为试验猪场,用正向间接血凝试验(IHA)检测猪瘟病毒(CSFV)和口蹄疫病毒(FMDV)抗体合格率;用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)抗体阳性率,分析免疫抑制状况。同时,采取临床可疑病料,用RT-PCR技术检测PRRSV、PCV2、CSFV和伪狂犬病毒(PRV)的感染率。结果显示:不同年龄猪群中,PCV2抗体阳性率都在96.0%以上,而CSFV、FMDV抗体合格率及PRRSV抗体阳性率呈现一致的变化趋势,即母猪最高,哺乳仔猪其次,培育猪和肥育猪最低;在病原检测中,PRRSV和PCV2检出率最高,分别为44.3%和60.7%。另外,双重感染和多重感染明显,特别是PRRSV+PCV2+CSFV三重感染,阳性率达7.6%。本试验结果为制定有效的免疫程序等防治措施提供科学依据。     

PRRSV ORF5基因和CSFV E2基因重组真核表达质粒的构建及小鼠免疫试验

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)已知序列设计3对引物,采用RTPCR方法扩增PRRSV ORF5基因和CSFV E2基因,目的基因依次插入真核表达载体pcDNA4.0,经PCR、酶切及测序分析,重组质粒构建成功,并命名为pcDNA4.0-ORF5-E2.重组质粒回收提纯后,以100 μg/只剂量免疫小鼠,免疫3次.三免后10 d采血并制备血清,用间接ELISA检测小鼠血清中PRRSV及CSFV抗体效价.结果显示,所构建的重组质粒能够诱导小鼠产生PRRSV及CSFV抗体.     

多重PCR对猪病毒性繁殖障碍疾病的调查分析

为了解猪群中病毒性繁殖障碍疾病的流行状况,用多重PCR诊断方法,对太原市附近14个养猪场和门诊病例共1068份样品进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）的检测,其平均感染率分别为：PRRSV 32%、CSFV 40%、PPV 20%、PRV 12%、PCV-2 27%。其中混合感染2种病毒的猪群为39%,感染2种病毒的猪为24%。用RT-PCR试剂盒对山西省11个地市66个猪场及121个散养户的1572份血样进行了PRRSV和CSFV的检测,结果PRRSV感染率为33%,CSFV感染率为46%。用间接血凝试验对61个县38个乡136个村179户的1593份血样进行了猪瘟免疫抗体的检测,平均合格率为43.9%,从而为防控此类疫病的发生,制定综合防制措施提供试验数据。     

Prime-boost immunization using alphavirus replicon and adenovirus vectored vaccines induces enhanced immune responses against classical swine fever virus in mice

This study was designed to evaluate the prime-boost vaccination regimens as a novel immunization strategy for DNA vaccine against classical swine fever virus (CSFV). BALB/c mice were primed with the alphavirus replicon-vectored DNA vaccine pSFV1CS-E2-UL49 encoding the E2 protein of CSFV fused with the UL49 gene encoding the transduction protein VP22 of pseudorabies virus, followed by either homologous boosting with pSFV1CS-E2-UL49 or heterologous boosting with the recombinant adenovirus rAdV-E2 expressing the E2 protein or with the baculovirus-produced recombinant E2 protein (rE2) in adjuvant. The humoral and cell-mediated immune responses following prime-boost vaccination were assessed. The results showed that: (1) boosting with either rAdV-E2 or rE2 elicited high-level antibodies, whereas homologous boosting with pSFV1CS-E2-UL49 elicited low-level antibodies (below positive threshold); (2) heterologous boosting with rAdV-E2 resulted in stronger CD8⁺ and CD4⁺ T cells proliferation responses and higher stimulation indexes; and (3) heterologous boosting with rAdV-E2 induced more IFN-γ production. These results support the notion that a regimen of DNA prime-recombinant adenovirus boost enhances humoral and cell-mediated immune responses, and the DNA prime-protein boost regimen enhances humoral immune responses.     

CSFV免疫状态下外周血T淋巴细胞亚群变化及对PRRS的免疫保护作用

建立CSFV疫苗免疫状态下猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染动物模型。测定CSFV抗体阻断率和PRRSV抗体S/P值,根据CSFV抗体阻断率和PRRSV感染情况分析猪外周血中T淋巴细胞亚群变化和对PRRS的保护促进作用。采用流式细胞术（FAC）检测猪外周血T淋巴细胞CD3、CD4、CD8亚群的变化。结果,CSFV...     

实时荧光定量PCR检测猪病料中的PRRSV与CSFV

根据GenBank发表的PRRSV、CSFV基因核苷酸序列,应用Primer 5.0软件分别设计了2对特异性引物.以重组质粒作为阳性标准品,应用SYBR Green I real-time PCR检测两种病毒的核酸含量.在样品稀释到10.1～10<'-11>拷贝时,能得出良好的线性关系,相关系数为R<'2>=0.999...