基于转录组学的粉葛葛根素生物合成相关基因挖掘

挖掘与粉葛葛根素生物合成的相关基因，为相关控制基因的验证及深入研究提供理论参考。对6个生长时期的粉葛块根进行转录组测序，在葛根素含量最高时期与最低时期初步筛选差异表达基因，对各时期葛根素及其上下游代谢物含量变化趋势与差异表达基因相对表达量进行相关性分析，最终挖掘出相关性较高的基因片段。结果表明，经2步筛选差异基因后，挖掘11个与粉葛葛根素生物合成相关的片段，共编码3个基因，分别为异黄酮羟化酶控制基因(I2′H)、异黄酮7-O-葡糖苷转移酶控制基因(IF7GT)和异黄酮合酶控制基因(IFS1),其中I2′H、IF7GT、IFS1均与葛根素的生物合成呈现正向相关，即均正向调控葛根素的生物合成。说明I2′H与IF7GT所编码的酶主要负责调控大豆苷元向芒柄花素和大豆苷的合成，两者同为葛根素上游代谢物的支链代谢物，因此与葛根素的含量呈正向相关，而IFS1则通过调控2,7,4′-3-羟基异黄酮的生物合成与异甘草素向葛根素的直接合成，最终调控葛根素生物合成进程。     

葛根新品种——宋葛4号

葛为我国原产的常用传统中药材,也是重要的经济作物,1998年3月国家卫生部已将它正式列入81种＂既是食品又是药材＂的名录之中。葛为药食两用植物,是生产食品、化工和医药产品的重要原料。葛根含葛根素、葛根素木糖甙、大豆黄酮、异黄酮及β谷甾醇、花生酸,又含多量淀粉（鲜葛根含淀粉19%～20%,干葛根含淀粉35%）。葛根经水磨而提取葛粉,葛粉含淀粉76.1%、蛋白质0.08%、纤维素0.36%、灰分0.2%和水分19.5%。本草纲目记载：葛根气味甘、辛、平、无毒,主治消渴、神大热、呕吐、诸痹、起阴气、解毒：疗伤寒中风头痛，解肌发表出汗、开且腠理、疗金疮、止胁风痛；治天行上气呕逆，开胃下食，解酒毒；治胸膈烦热发狂、止血痢、通小肠、排脓破血；傅蛇虫啮，毒箭伤；生者堕胎,蒸食消酒毒。可断谷不饥。作粉止渴，利于小便，解酒，去烦热,傅小儿热疮，捣汁饮治小儿热痞，大伤，散郁火。     

葛根中总黄酮及葛根素的含量测定

采用UV、LLC对葛根不同部位中总黄酮与葛根素的含量进行了测定。结果表明：总黄酮以峨眉葛块根含量最高，达7．23％，野葛叶含量最低，仅为1．00％；葛根素的含量以峨眉葛块根最高，达4．06％，野葛叶最低，仅为0．103％。     

超声微波协同萃取葛根中葛根素工艺的研究

[目的]探究利用超声微波协同萃取葛根中葛根素的提取工艺,以期为葛根素的工业化生产提供新思路。[方法]采用单因素试验和正交试验,以葛根素得率为指标,分别考察微波功率、提取时间、乙醇浓度、料液比及浸泡时间对葛根素提取的影响。[结果]在超声微波协同作用下,葛根素的最佳提取工艺为：微波功率为250W,提取时间为25s,乙醇浓度为50%,料液比为1：20,浸泡时间为30min。在此条件下,葛根素得率为0.6376%。[结论]超声微波协同萃取葛根素具有萃取效率高、节省时间、节省溶剂、节能、污染小等优点。     

葛根素的大孔树脂纯化及抗氧化性研究

主要研究了大孔树脂纯化葛根素工艺及抑菌性质。以葛根素吸附率为指标,通过正交试验确定大孔树脂纯化葛根素最佳工艺条件,即上样液浓度0.8 g·m L-1,吸附流速9 BV·h-1,乙醇浓度80%,洗脱流速4 BV·h-1。同时试验结果表明,葛根素对羟自由基具有较强清除能力,因此,葛根素具有较好的抗氧化活性。     

葛根素对松辽黑猪前体脂肪细胞成脂分化的影响

为探究葛根素对松辽黑猪前体脂肪细胞成脂分化的调控作用,在细胞诱导液中分别添加0、10、20、40、60和80 μmol/L葛根素进行成脂诱导分化,用油红O染色法和甘油三酯酶法检测脂肪细胞分化过程中脂滴聚集情况和甘油三酯含量以考察脂质沉积和分化效果,并确定葛根素的最佳添加浓度;用实时荧光定量PCR检测对照组(0 μmol/L)和最佳葛根素浓度添加组成脂标志基因细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT-增强子结合蛋白α(C/EBPα)及成脂分化基因乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸结合蛋白(FABP4)、应激蛋白(TRIB)和叉头框蛋白O1 (FOXO1)的mRNA的表达水平,用Western blotting检测PPARγ和C/EBPα的蛋白表达水平。结果表明,与对照组相比,20、40和60 μmol/L葛根素均显著增加脂滴和甘油三酯含量(P<0.05),且40 μmol/L葛根素效果最佳;实时荧光定量PCR结果表明,与对照组相比,40 μmol/L葛根素显著上调成脂标志基因PPARγ、C/EBPα及成脂分化基因ACC、FABP4、FOXO1和TRIB的表达(P<0.05);Western blotting结果显示,与对照组相比,40 μmol/L葛根素显著增加PPARγ蛋白表达(P<0.05)。综上所述,40 μmol/L葛根素能够促进松辽黑猪前体脂肪细胞的成脂分化和脂质沉积。     

葛根素缓解镉对大鼠股骨胫骨中成骨细胞分化的抑制作用

旨在探究葛根素对镉（cadmium,Cd）抑制大鼠股骨胫骨中成骨细胞（osteoblast,OB）分化的缓解效应。选取40只3周龄SD雄性大鼠,随机分为4组,分别为对照组（CON）、镉组（Cd）、葛根素组（Pur）和镉+葛根素组（Cd+Pur）,每组10只。其中,对照组和镉组大鼠灌服超纯水,连续5周;含葛根素组（葛根素组和镉+葛根素组）大鼠每日灌服葛根素溶液（200 mg·kg^-1BW）,连续5周;从第5周开始,对照组与葛根素组大鼠每日腹腔注射生理盐水,含镉组（镉组和镉+葛根素组）大鼠每日腹腔注射醋酸镉（2.5 mg·kg^-1BW）,连续1周。通过原子吸收光谱法检测大鼠股骨胫骨中Cd、钙（Ca）与磷（P）的含量,qRT-PCR方法检测OB标志基因（RUNX2、OCN、ALP和OSX）的水平,Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白（β-catenin、Wnt3A、LEF1和TCF1）的表达。结果显示,与对照组相比,镉组股骨和胫骨中镉含量极显著上调（P<0.01）,OB标志基因均下调,Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白极显著下调（P<0.01）,但Ca和P含量无显著变化（P>0.05）;葛根素组股骨胫骨中镉、Ca与P含量无显著变化（P>0.05）,OB标志基因（RUNX2、ALP和OCN）极显著上调（P<0.01）,Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白极显著上调（P<0.01）;与镉组相比,镉+葛根素组股骨胫骨中镉含量极显著下调（P<0.01）,OB标志基因极显著上调（P<0.01）,Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白极显著上调（P<0.01）,但骨中Ca与P含量无显著变化（P>0.05）。结果表明,葛根素对镉抑制大鼠OB分化具有一定的缓解效应,该过程涉及Wnt/β-catenin信号通路。     

葛根素对镉致大鼠血脑屏障损伤的保护效应

为探究葛根素在镉暴露引起大鼠血脑屏障损伤中的保护效应,24只雄性SD大鼠随机分为4组,分别为对照组、葛根素组、镉组、镉与葛根素共处理组。试验期间,每天按200 mg/kg剂量的葛根素(溶解于5 g/L羧甲基纤维素钠)对葛根素组、镉与葛根素共处理组大鼠进行灌胃,同时以相同剂量的5 g/L羧甲基纤维素钠将对照组、镉组大鼠进行灌胃;14 d后,镉组、镉与葛根素共处理组大鼠在灌胃的同时自由饮用镉水(50 mg/L),持续90 d。试验结束后,分离大鼠大脑皮质,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测神经型一氧化氮合酶(nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)基因表达量,微板法测定一氧化氮(NO)含量,Western blot检测MMP-9、白蛋白(ALB)表达水平,免疫组化染色检测ALB分布情况。结果显示:和对照组相比,镉组nNOS、iNOS mRNA水平,NO含量,MMP-9 mRNA和蛋白水平,ALB蛋白水平极显著升高(P<0.01);与镉组比较,镉与葛根素共处理组nNOS、MMP-9 mRAN水平,NO含量极显著下降(P<0.01),iNOS...     

超微粉碎对葛根芩连汤中葛根素、黄芩苷溶出的影响

将葛根芩连汤加工成细粉（40-65目）和超微粉（300目）,高效液相色谱法（HPLC）测定葛根芩连汤细粉和超微粉中主要有效成分葛根素、黄芩苷的含量,研究超微粉碎技术对葛根芩连汤主要有效成分葛根素、黄芩苷溶出的影响。结果葛根芩连汤细粉和超微粉中葛根素的含量分别为2.05%、3.20%;葛根芩连汤细粉和超微粉中黄芩苷含量分别为2.78%、3.94%。葛根芩连汤超微粉中的葛根素、黄芩苷含量比细粉分别提高56.10%、41.73%。表明超微粉碎技术能显著提高葛根芩连汤中主要有效成分葛根素和黄芩苷的溶出度。     

葛根素提取工艺及其表征的研究

通过对野葛根中葛根素的分离提纯研究,发现溶剂的浓度对葛根素的收率及酸解过程中盐酸浓度对葛根素晶体纯度的影响均非常明显。为此,对这两个因素做进一步研究,结果表明：45%乙醇抽提时收率达2%;5%盐酸酸解时纯度达95.8%。并对提取物结构进行了1H NMR1、3C NMR、MS、IR表征。为进一步研究葛根素的应用奠定了基础。