高职院校"鸡新城疫抗体水平测定"技能大赛操作要点探索

由农业部主办的全国职业院校鸡新城疫抗体水平测定技能大赛赛项是高职院校中规模最大、水平最高、竞争最激烈的比赛项目之一。为了更好的提高学生的专业技能以及在以后的比赛中取得更突出的成绩,本文从实验器材的准备、配制1%鸡红细胞悬液、血凝(HA)实验、配制四单位病毒、血凝抑制(HI)实验和抗体滴度报告等六个操作环节进行了初步分析,以供从业者参考。     

山鸡H5N1高致病性禽流感免疫效价评估试验

长期以来,山鸡H5N1高致病性禽流感的免疫一直引用了家禽的免疫程序,也未能开展系统的免疫抗体消长规律的研究,给山鸡规模化养殖带来了较大的隐患。为此,于近期组织开展了一次针对种山鸡全周期(一个世代、56周)H5N1高致病性禽流感免疫抗体的跟踪检测和免疫效价评估试验,并分析提出了山鸡专用的H5N1高致病性禽流感推荐免疫程序。     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）灭活疫苗菌株，本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株，测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖（LPS）含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价，并进行了攻毒保护试验。结果显示，分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多，均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因；免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应，在二免后14 d血清抗体达1：64~1：128，强毒攻毒后全部存活，而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明，Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株，其中Pm3作为首选株。     

猪瘟病毒结构蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立及评价

通过研究猪瘟(CSF)疫苗免疫猪抗结构蛋白E2、E0和C抗体的产生规律,为临床制定合理的CSF疫苗免疫程序提供参考。利用间接ELISA方法检测CSF疫苗免疫猪过程中,抗E2抗原血清抗体的产生特征;分别以重组猪瘟病毒(CSFV)结构蛋白E0和C为抗原,建立检测血清抗体的间接ELISA方法,评价其敏感性和特异性,并检测疫苗免疫过程中抗E0和C蛋白抗体的消长规律。结果显示:CSFV-E0和CSFV-C间接ELISA抗体检测方法的抗原最佳包被质量浓度分别为2.09和1.59μg/mL,待检血清样本最适稀释度分别为1∶60和1∶80,酶标二抗稀释度分别为1∶100和1∶350,2种ELISA方法与常见猪病原的阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性。CSF疫苗免疫后第7天即可检测到抗E2、E0和C蛋白的抗体,其中抗E2和E0的抗体在免疫后第21天达到最高水平,E2抗体滴度先上升后下降,E0抗体在免疫后第21天开始下降并最终趋于稳定;C蛋白抗体在免疫后第7天出现,随后开始下降,在第28天转为阴性。结果表明,利用重组抗原建立的CSFV血清抗体ELISA检测方法,可以用于评价CSF疫苗免疫后血清中针对3种结构蛋白的抗体消长特点,从而为临床猪瘟疫苗免疫程序的制定提供参考。     

鲤细胞因子多克隆抗体的制备及检测

为从蛋白质水平研究细胞因子在鲤体内免疫应答过程中的合成变化,本研究采用PCR技术克隆TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β基因含有部分抗原决定簇的片段,引入双酶切位点Bam HⅠ和HindⅢ后连接至p ET-32a/21a,构建相应的表达载体,制备多克隆抗体。采用ELISA检测抗体效价,并以此作为实验工具,检测经嗜水气单胞菌感染后鲤血清中炎性细胞因子的合成变化。结果显示,基因TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β融合蛋白分子量分别约为31.8、31.7、35.3、32.5、18.0和33.6 ku;抗体效价达到2.4×106;在病原菌感染后的不同阶段,促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和抗炎细胞因子IL-10、TGF-β呈现出不同的合成变化。研究表明,制备的抗体具有较高的效价、亲和力和特异性,可用于鲤细胞因子的定量研究,该抗体的获得为鲤免疫应答与细胞因子合成的系统研究奠定了基础。同时,获取的鲤细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β的抗体亦可用于其他鱼类细胞因子蛋白质水平的定量研究。     

禽安卡拉病毒Hexon蛋白多克隆抗体的制备

为进一步建立Ⅰ群血清4型禽腺病毒(FADV-4)的特异性检测方法,根据本实验室分离鉴定的安卡拉病毒的基因组序列,设计针对六邻体蛋白(Hexon)基因的特异性引物,经PCR扩增,连接至p ET-28a中,构建原核表达载体p ET-28a-Hexon。将其转化感受态BL21中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE分析,获得重组蛋白大小为49 ku。Western blot分析纯化后重组蛋白能与FAd V-4阳性血清发生特异性反应。将纯化后的重组蛋白免BALB/c小鼠,制备了六邻体蛋白多克隆抗体,采用间接ELISA方法测定效价表明制备的血清效价大于1∶64 000。     

家蚕glial cell missing(BmGcm)基因鉴定、表达、亚细胞定位和功能

【目的】鉴定、克隆家蚕(Bombyx mori)glial cell missing(Bm Gcm)基因,分析其m RNA表达及亚细胞定位特征。制备多克隆抗体,同时在细胞水平进行过表达,检测Gcm对细胞增殖和周期的影响,为探究Bm Gcm功能打下基础。【方法】利用RACE方法克隆获得Bm Gcm全长c DNA序列,利用ORF Finder和SMART等在线工具对Bm Gcm基本序列特征和结构信息进行分析,运用Clustalx和MEGA 6.0等软件对多物种Gcm蛋白进行同源序列比对和进化分析。采用RT-PCR和q RT-PCR方法检测Bm Gcm的表达情况。利用原核表达系统获得重组蛋白,通过蛋白纯化和免疫小鼠制备多克隆抗体,运用Western blot对抗体进行检测。构建Bm Gcm表达载体,转染家蚕胚胎细胞系,分析其亚细胞定位情况,同时利用EDU细胞增殖标记和流式细胞仪对其功能进行探索。【结果】Bm Gcm(BGIBMGA006182)定位于4号染色体的nscaf2847上,其基因全长4 046 bp,包含4个外显子和3个内含子。其c DNA全长1 734 bp,包含166 bp的5′UTR、227 bp的3′UTR和1 341 bp的完整开放阅读框(ORF)。该基因编码446个氨基酸残基,预测蛋白分子量为50.61 k D,等电点5.557,含有典型的GCM结构域。多重比对结果显示GCM结构域在不同物种间具有高度的保守性,进化分析显示昆虫Gcm蛋白单独聚为一支,其中Bm Gcm蛋白与帝王蝶同源蛋白亲缘关系最为接近。表达分析结果显示Bm Gcm在胚胎发育第4天表达达到峰值,随后表达水平逐渐下调,而在幼虫阶段,Bm Gcm主要表达于中肠、精巢和卵巢。将Bm Gcm完整的开放阅读框序列构建至原核表达系统,经IPTG诱导和亲和层析纯化获得高纯度重组蛋白,通过免疫小鼠获得了多克隆抗体,Western blot检测该抗体可以特异性识别重组蛋白。在家蚕细胞系中过表达Bm Gcm蛋白,结果显示其定位于细胞核。在细胞水平,过表达Bm Gcm会明显抑制细胞增殖,将细胞周期阻滞于G1/S期。【结论】克隆鉴定得到Bmgcm全长序列,获得其表达和亚细胞定位信息。通过原核表达、蛋白纯化和免疫小鼠制备了可用的多克隆抗体。细胞实验发现Bm Gcm可以显著抑制增殖和影响正常的细胞周期进程。     

云南某犬场犬狂犬病灭活疫苗免疫抗体效价评估

采用直接免疫荧光病毒中和试验(FAVN),对云南某犬场狂犬病灭活疫苗免疫28 d后的犬群随机抽样44只(份),检测血清中狂犬病病毒抗体效价。结果显示,44只受试犬,14只阳性(≥0.50 IU/m L),阳性率31.82%(14/44);狂犬病灭活疫苗免疫1次的31只受试犬(幼犬14只、训练犬17只),3只阳性,阳性率9.68%(3/31);免疫2次及2次以上的13只受试犬(3只训练犬,10只种犬),11只阳性,阳性率84.62%(11/13)。调查显示,该犬场狂犬病灭活疫苗免疫覆盖率为100%。笔者建议:在犬12月龄前,应进行两次狂犬病灭活疫苗免疫;在幼犬3月龄后进行第1次免疫,间隔1个月后进行第二次狂犬病灭活疫苗加强免疫,消除狂犬病免疫空挡,以后每年进行1次免疫;对于监测过程中,出现血清中和抗体效价低于0.50 IU/m L的犬只,应及时加强免疫1次;并加强犬场周围流浪犬、流浪猫管理。     

种鸡开产前免疫不同新城疫-传染性支气管炎-禽流感H9三联油苗的效果观察

为了探讨尽可能延长母鸡开产后免疫保护期的可能性,本试验选用市售的两种新城疫(ND)-传染性支气管炎(IB)-禽流感(AI)H9三联灭活商品疫苗在广西地区主要地方品种三黄鸡的两个品系黄1和黄2上分别进行对比免疫试验。种鸡开产前的150日龄分别使用疫苗A(精制浓缩型油苗)、疫苗B(普通油苗)免疫,然后分别于免疫时以及免疫后的1个月、2个月、3个月、4个月和5个月分别使用HI试验和ELISA测定两组鸡只相应产生的血清抗体滴度。结果表明,在黄1品种上的试验,疫苗A免疫组的ND抗体水平高于疫苗B免疫组,两组鸡的H9、IB抗体水平则无明显差异;在黄2品种的试验,疫苗A免疫组的ND、H9、IB抗体水平均高于疫苗B免疫组;开产前免疫疫苗A后5个月,黄1和黄2品种均仍能维持较高的抗体水平,其中黄1品种可推迟补免时间20多天,黄2品种推迟补免时间1个月。