不同乳酸菌组合对苜蓿青贮细菌群落结构的影响

为探讨不同乳酸菌互作对苜蓿（Medicago sativa）青贮细菌群落结构的影响，以2种植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌及凝结芽孢杆菌形成的6种乳酸菌组合按1.5 mL·kg^-1的添加量制作苜蓿青贮，以等量蒸馏水替代添加剂作为对照，45 d后运用高通量测序分析细菌群落结构。结果表明，各苜蓿青贮的优势乳酸菌群均为厚壁菌门（Firmicates）的乳杆菌属（Lactobacillus）和片球菌属（Pediococcus），二者相对丰度之和为65.4%~79.0%，其中含植物乳杆菌处理高于对照和含凝结芽孢杆菌处理；与对照相比，乳酸菌组合处理提高了菌群Chao1和ACE指数但降低了Simpson和Shannon指数；6个乳酸菌组合处理中，含凝结芽孢杆菌处理组与对照相似性较高，对苜蓿青贮细菌群落影响较小；相关分析表明，苜蓿青贮菌群结构和多样性可较好地解释其营养品质的变化。综上，乳酸菌组合在一定程度上改善了苜蓿青贮的细菌群落结构，其中含植物乳杆菌的组合效果较好。     

微生物发酵制备沙棘果浆酵素的研究

笔者针对沙棘果浆筛选合适的微生物发酵剂,并探究试验条件下最佳的发酵工艺,为沙棘产品的开发提供依据。结果发现,沙棘原浆可溶性还原糖含量为17.2 mg/mL,总酸含量为26.90 g/L,总黄酮含量为7.294 mg/mL.沙棘果泥酵素发酵工艺采用酵母菌和乳酸菌混合菌发酵方式,酵母菌粉的接种量为0.01%,乳酸菌粉的接种量为0.1%,发酵条件为37℃,发酵40 h效果最佳。经40 h发酵后,沙棘中可溶性还原糖含量为2.481 mg/mL,总酸含量为20.493 g/L,总黄酮含量为11.187 mg/mL.     

表面展示C型产气荚膜梭菌α,β毒素蛋白重组乳酸菌的 构建及反应原性分析

构建表达C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白的重组乳酸菌,并对表达蛋白反应原性进行鉴定。通过PCR构建pSIP409-pgsA’-α,pSIP409-pgsA’-β1以及pSIP409-pgsA’-β2质粒,并将三种质粒电转入植物乳杆菌NC8后诱导表达,通过Western-blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。构建的NC8-pSIP409-pgsA’-α,NC8-pSIP409-pgsA’-β1以及NC8-p SIP 409-pgsA’-β2三种重组乳酸菌能成功表达C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白,三种表达的融合蛋白大小分别为61 kDa、52 kDa以及46 kDa。三种重组乳酸菌表达了C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白且与制备的多抗具有良好的反应原性,为C型产气荚膜梭菌口服疫苗的研制奠定基础。     

富硒乳酸菌中药制剂对育肥猪免疫、抗氧化能力的影响

本试验旨在研究富硒乳酸菌中药制剂(LSTCM)对育肥猪免疫、抗氧化能力的影响。选取日龄相近、体重(57±1.50)kg、体况良好的杜×长×大三元杂交育肥猪60头,分为4个组,每组3个重复,每重复5头猪。对照组饲喂基础日粮,试验组分别在基础日粮中添加0.1%、0.3%、0.5%的LSTCM(硒含量为100 mg/kg)。预试期10 d,正试期60 d。结果表明:与对照组相比,0.3%、0.5%LSTCM组IgA含量极显著提高,而IgG及IgM含量显著提高;与对照组相比,0.3%LSTCM组血清、肌肉、肝脏中总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均提高(P<0.01),肾脏中T-AOC、SOD活性均提高(P<0.01),GSH-Px活性提高(P<0.05),血清、肌肉、肾脏中丙二醛含量均降低(P<0.01),肝脏中降低(P<0.05)。综上所述,富硒乳酸菌中药制剂能显著提高育肥猪免疫能力以及血清及组织的抗氧化能力。     

秸秆饲料化全细胞纤维素酶的构建及应用

为提升秸秆饲料的品质，通过构建全细胞酿酒酵母纤维素酶，探究全细胞纤维素酶用于秸秆饲料化的应用前景。通过与其他青贮菌剂对比用于秸秆饲料化发酵，比较分析全细胞酿酒酵母纤维素酶在秸秆饲料化中的应用效果。试验发酵条件设置为：发酵温度28℃，发酵时间14 d，真空厌氧发酵。结果表明：与乳酸菌发酵相比，纤维素酶与乳酸菌混合发酵的玉米秸秆铵态氮/总氮比没有明显上升（P>0.05），因此不会造成饲料中的蛋白过量分解；纤维素含量显著下降（P<0.01），相比未发酵秸秆下降15.03个百分点，比乳酸菌发酵效果提高一倍以上，与商用青贮剂发酵效果相当；半纤维素含量相比未发酵秸秆下降2.70个百分点。研究表明酿酒酵母全细胞纤维素酶与乳酸菌混合处理秸秆，可提高纤维素酶酶解效率，有效减低秸秆中纤维素、半纤维素含量，酶解产物可加速乳酸菌发酵进程，全细胞酶可增加秸秆单细胞蛋白含量，实现玉米秸秆发酵效果、营养价值和利用效率的同步提升。     

抑制黄曲霉菌的乳酸菌的分离及鉴定

【目的】从新疆传统发面面肥中分离筛选出能够抑制黄曲霉菌生长的乳酸菌,为改善和提高青贮饲料品质提供优良菌种。【方法】采用实验室纯培养方法对新疆传统发面面肥样品进行乳酸菌的分离,采用双层平板法筛选对发霉花生、玉米和变质青贮饲料中黄曲霉菌具有抑制作用的乳酸菌,并对其进行生理生化鉴定及同源性分析,构建系统发育树,明确各菌株的分类地位。【结果】从新疆传统发面面肥中分离出12株乳酸菌,通过抑菌试验筛选出F3、F11和F12 3株对黄曲霉菌具有抑制作用的菌株。生理生化试验发现,3株菌株均能在5,10,40和45℃温度条件下生长,在NaCl为3%和6.5%,pH 4~7条件下能良好生长,并且这3株菌均能利用多种碳源。经16SrDNA序列同源性分析,菌株F3与类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)MD9B2的同源性为100%,菌株F11与屎肠球菌(Enterococcus faecium)V9-156的同源性为100%,菌株F12与乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)25F1的同源性为100%。【结论】从新疆传统发面面肥中筛选出能够抑制黄曲霉菌的3株乳酸菌,经鉴定分别为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。     

具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的益生乳酸菌筛选

利用α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选模型，分析了来源于传统乳制品的10株乳杆菌对猪小肠提取的α-葡萄糖苷酶的抑制活性；对这些菌株的基本益生特性，包括对人工模拟胃肠液的耐受性及对肠上皮细胞的粘附性等进行了评价；最后，通过Caco-2细胞建立的Transwell模型分析了乳杆菌对人肠道α-葡萄糖苷酶活性及其基因表达的影响。结果表明，这10株乳杆菌对猪小肠提取的α-葡萄糖苷酶均具有不同程度的抑制作用；乳杆菌的α-葡萄糖苷酶抑制活性在菌株生长的对数期或稳定期达到高峰，随后出现下降的趋势；结合菌株的基本益生特性评价发现，有3株具有较高抑制活性的乳杆菌能够耐受人工模拟的胃肠液，并具有较强的黏附肠上皮细胞HT-29的能力；由Transwell模型发现，乳杆菌能同时抑制α-葡萄糖苷酶的活性及基因表达量。研究表明，筛选出的3株乳杆菌（副干酪乳杆菌L14和Z3-11以及植物乳杆菌NL42）均具有较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性和较好的益生特性，可作为潜在的辅助降血糖的益生菌株。     

饲用复合菌剂对玉米秸秆青贮品质的影响

本试验旨在研究添加复合菌剂对青贮玉米秸秆感官品质和营养物质动态变化的影响。试验以玉米秸秆为原料,设置对照组和3个试验组,3个试验组均按照原料的干物质重量添加3%乳酸菌液、2%酵母菌液和3%黑曲霉菌液,另分别添加3%、2%和1%芽孢杆菌液,对照组添加等体积蒸馏水。试验在不同发酵时间(0、3、7、14、21、28、42、60 d)动态取样,测定玉米秸秆中乳酸菌、酵母菌和pH随时间的变化规律,同时进行营养物质差异性分析。结果表明:试验组青贮60 d后感官评价优于对照组,添加复合菌剂可增加青贮玉米秸秆的乳酸和粗蛋白质含量(P<0.05),降低酸性洗涤纤维含量(P<0.05);各试验组乙酸、总酸含量与对照组相比有增加趋势;0～3 d各组pH下降显著,7 d后pH基本保持稳定,小于3.8,试验组和对照组的乳酸菌和酵母菌活菌数3 d时达到峰值,此后随着pH降低酵母菌和乳酸菌数量逐渐下降。添加复合菌可以改善玉米秸秆青贮饲料发酵品质,有利于青贮玉米秸秆的长期保存。     

野猪粪便中乳酸菌的分离鉴定及特性研究

【目的】筛选安全的、具有优良特性的乳酸菌菌株,进一步研发益生制剂,为饲料添加剂等动物相关产品提供资源。【方法】从我国黑龙江省大兴安岭地区采集野猪粪便样品13份,编号后置于4℃保温箱迅速运回实验室,利用MRS培养基分离纯化乳酸菌。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株的基因组DNA,利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR鉴定,将扩增得到的序列测序后在NCBI上使用BLAST与GenBank数据库中序列进行对比分析,确定各菌株的分类学地位。将鉴定后的乳酸菌菌株分别接种于酸性（pH 3.0）和含胆盐（0.3%）的MRS培养基,在不同条件下评价乳酸菌菌株的耐酸、耐胆盐特性。将过夜培养的乳酸菌于室温条件下静置,在不同时间测定其OD_600nm,进行自凝集能力评价;过夜培养的菌株分别与致病性埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌3种致病菌混合后于室温静置,进行共凝集能力检测。在体外,分别进行乳酸菌菌株对Caco-2细胞和IPEC-J2细胞的黏附能力测定,评价不同菌株的黏附能力。通过测定乳酸菌菌株对致病性埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌3种致病菌的抑菌环直径,评价分离菌株的抑菌活性。通过体内外试验评价乳酸菌菌株的安全性。在体外,分别以模式菌株嗜酸乳杆菌和金黄色葡萄球菌作为阴性对照和阳性对照,将3株乳酸菌菌株和对照菌株在血平板上划线,37℃厌氧孵育18—24 h,观察细菌菌落周围是否形成溶菌环,评价分离菌株的溶血特性。使用文献中已报道的毒力因子引物对分离的乳酸菌菌株进行PCR扩增,检测是否存在毒力因子的编码基因,评估分离菌株的安全性。在体内,将过夜培养的乳酸菌连续饲喂7周龄的BALB/c小鼠21 d,分别测定小鼠的初始体重和最终体重,观察计算体重变化情况;饲喂21 d后,解剖获取小鼠的脾脏、肝脏和肾脏计算器官指数,评价分离乳酸菌菌株的体内安全性。【结果】从野猪粪便中分离得到3株对酸和胆盐具备一定耐受力的乳酸菌,经鉴定分别为蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）、耐久肠球菌（Enterococcus durans）和黏膜乳杆菌（Lactobacillus mucosae）。3株乳酸菌菌株均表现出较强的自凝集能力和对致病菌的共凝集能力,同时对Caco-2细胞和IPEC-J2细胞均表现出较强的黏附能力,抑菌试验结果显示黏膜乳杆菌对3种致病菌均具备较强的抑菌活性。经体内外安全性评价,3株乳酸菌菌株无溶血性,且均未检测到毒力基因,经其连续饲喂的小鼠行为表现正常、状态良好,其中,与对照组相比,黏膜乳杆菌饲喂后小鼠增重显著。【结论】从大兴安岭野猪粪便中分离的3株乳酸菌（特别是黏膜乳杆菌）具有良好的特性和安全性,具备进一步开发益生菌制剂的潜力。