猪胸膜肺炎放线杆菌PCR诊断方法的建立与应用

根据胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因设计1对引物，扩增特异的650bp棱酸片段，建立了应用PCR检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。特异性试验结果表明，12个血清型的放线杆菌参考菌株均能扩增出650bp特异性的核酸片段，而大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体、伤寒沙门氏菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明，PCR的最低检出限量为500个放线杆菌。利用建立的PCR检测方法对22株从山东省不同地区分离的疑似胸膜肺炎放线杆菌菌株进行检测．结果14株为阳性。对感染猪病变组织的检测结果表明，病变部位不同，胸膜肺炎放线杆菌的检出率不同，其中以扁桃体的检出率最高。  

洛阳地区规模化猪场传染性胸膜肺炎的血清学调查

猪传染性胸膜肺炎（PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的猪的一种高度传染性呼吸道疾病。目前，虽然国内已发表多篇有关PCP的血清学的调查报告，但有关PCP流行规律的更为详细的问题人们了解的还不全面。近年来，洛阳地区的多数猪场一直受到PCP的危害，为此，我们对洛阳地区部分规模化猪场不同阶段猪群进行了传染性胸膜肺炎血清学调查。  

胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素结构基因的原核表达以及重组蛋白的免疫原性分析

猪传染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25—4株为研究对象，对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序，并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E．coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在，包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western—blotting免疫印迹实验，结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。  

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板，PCR方法扩增出apx ，ⅢA基因3．1kb的片段，扩增产物克隆于pMD18-T中，重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apx11A基因进行比较，结果显示核苷酸同源性均在96％以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ／Sal Ⅰ位点，成功构建了重组表达载体pGEX—apx ⅢA，转化大肠杆菌BL-21（DE3）中并获得表达。SDS—PAGE结果显示，表达的融合蛋白分子量约为140Ku，与预测相符，Western blot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。  

免疫程序的制定与实施

近年来，随着养猪业的迅速发展，种猪的交流，商品猪的频繁调动，使猪场的病源体增多，疾病变得繁杂而严重。尤其是引种，极易带人潜伏在新种猪中的病原。同时随着规模化和集约化养猪的发展，猪场的养殖规模越来越大，猪场存栏猪只越来越多，控制疾病的难度也越来越大。疾病成为养猪业的重要障碍之一，防疫已成为猪场的第一生命线。目前猪病的发生呈现出一种非典型化的趋势，该趋势给兽医诊断带来很大的困难，如非典型猪瘟的出现，猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病毒、猪瘟病毒的持续性感染以及传染性胸膜肺炎的持续性感染等。疾病流行谱也发生了巨大的变化，如猪流行性感冒和PRRS以及猪断奶后多系统衰弱综合征（PMWS）的从无到有，猪胸膜肺炎放线杆菌和猪副嗜血杆菌及猪伪狂犬病的危害逐渐加大。  

替米考星对猪传染性胸膜肺炎的治疗试验

为了解替米考星对猪传染性胸膜肺炎的疗效并为临床应用该药提供科学依据,将60头仔猪分为6 组(替米考星高、中、低剂量组及健康、感染和土霉素3 个对照组)进行人工感染试验。结果表明,国产替米考星拌料给药对治疗猪胸膜肺炎放线杆菌病具有明显的效果,可降低死亡率,提高成活率,减少人工感染引起的病理损伤;替米考星中、高剂量组(200 mg/kg饲料、400 mg/kg饲料)疗效尤为显著,因此临床治疗推荐剂量为200 mg/kg饲料,连用7 d。  

猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的PCR鉴定

据胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）生物I型各血清型之间外毒素（apx）基因组结构差异,参考GenBank上已发表的4种毒素（apxⅠ/apxⅡ/apxⅢ/apxⅣ）的核酸序列设计了6对特异性引物,对APP的12个血清型进行多重PCR扩增,得出不同的特异性的扩增片段,得以准确鉴定APP生物I型中的9种血清型,但其中血清型2和8,血清型5、9和11仍未能区分。  

套式PCR和实时荧光PCR在检测胸膜肺炎放线杆菌上的应用

应用胸膜肺炎放线杆菌套式PCR和实时荧光PCR检测方法分别检测了不同来源的猪鼻拭子、肺、扁桃体等494份样品。套式PCR 77份阳性,实时荧光PCR 62份阳性,前者的阳性完全覆盖了后者的阳性,两者符合率为97%(479/494)。2种方法均可应用于猪传染性胸膜肺炎的诊断和监测。  

硫酸头孢喹肟治疗猪细菌性呼吸道病的疗效试验

头孢喹肟属第4代头孢类抗生素,抗菌谱广,抗菌活性强,对临床分离的各种革兰氏阳性菌菌、革兰氏阴性菌的MIC50、MIC50值均较小[1].  

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxI A毒力基因的克隆及序列分析

ApxI A为猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)的重要毒力基因,经PCR扩增从APP标准1型菌株得到长为3 069 bp的ApxI A基因,将该基因克隆到pMD-18 Tsimple Vector载体,重组质粒经PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定,与GenBank收录的其它ApxI A基因序列比较分析,核酸序列同源性在98%~99%之间。APP的ApxI A基因的获得,可为进一步研究该基因及建立有效的诊断方法奠定基础。