南非II型口蹄疫间接ELISA检测方法的建立

为满足口岸对南非II型口蹄疫检测、监测的需求,在对南非II型口蹄疫抗原表位分析及相关基因合成的基础上,进行融合蛋白pGEX—VP1-VP3的体外表达,采用柱上酶切方法制备VP1-VP3蛋白。将纯化VP1-VP3抗原包被96微孔板,分别优化抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度,确定阴性临界值。经反复优化,建立的南非II型间接ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度为6．4ug／ml,血清最佳稀释度为1：200,酶标二抗最佳稀释度为1：4000,阴性临界值（0D450）为0．562。检测样品判定标准为：OD450〉0．622为阳性,OD450〈0．502为阴性,0．502≤OD450≤0．622为可疑。特异性试验结果表明,所建立方法与其它血清型口蹄疫间无交叉反应。南非II型口蹄疫间接ELISA检测方法的建立为我国口岸口蹄疫检疫提供了新的查验方法。     

轮状病毒套式PCR方法的建立

轮状病毒(Rotavirus,RV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属.现已证实RV是婴幼儿和各种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原之一.猪RV在无其他病原存在的实验条件下可引起悉生猪和未食初乳的猪发生严重的胃肠炎和绒毛萎缩.RV的基因组由11节段的双股RNA组成.所有的11个节段都有同样的末端结构,具有5'm'GPPPPGm,3'末端无Poly(A)尾,单一长开放阅读框架(open readingframe,ORF'),缺乏聚腺苷酸序列.ORF两端为5'和3'端的非编码区(5'-and 3'-terminal untranslated regions,UTRs).     

基于PCR及焦磷酸测序技术的单孢子虫鉴定技术研究与应用

为适应口岸单孢子虫快速、准确、高通量检测的需求,建立一种基于PCR及焦磷酸测序技术平台的单孢子虫鉴定方法。以OIE推荐的PCR扩增方法获得单孢子虫特异基因,根据此基因的保守序列利用焦测序软件PyroMarkQ96ID设计专用引物进行PCR扩增及焦磷酸测序,测得序列经比对分析确定为单孢子虫序列。同时采用PCR焦磷酸测序方法和OIE推荐的PCR方法对牡蛎样品进行检测。结果表明,所建立的检测方法可从基因序列水平上准确鉴定牡蛎样品中的单孢子虫,且检测结果与OIE方法的检测结果一致。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白的表达及单抗制备

为制备非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体,本研究扩增p54蛋白的胞外区编码基因,分别克隆到p ET30a和p GEX-6p-1中,构建了p54-p ET30a和p54-p GEX-6p-1重组质粒;将质粒分别转化到大肠杆菌BL21中,表达C末端带6个His、N端带有GST的p54重组蛋白;利用亲和层析的方法,富集和纯化带His标签的p54蛋白;以带His标签的p54蛋白为抗原,免疫BALB/C小鼠,制备单克隆抗体;以带有GST标签的p54蛋白为抗原,对制备的单抗进行特异性验证。结果显示:大肠杆菌能高效表达带His标签和GST标签的非洲猪瘟p54蛋白;His标签的p54蛋白免疫BALB/C小鼠后,得到了3株单克隆抗体;Western blot结果表明,3株单克隆抗体能与带有GST标签的p54蛋白相互反应。本研究成功制备了p54的单克隆抗体,为进一步开展非洲猪瘟ELISA、Western blot和细胞免疫荧光检测技术的开发研究奠定了基础。     

含组氨酸蛋白标签的蓝舌病假病毒物质构建及定量分析

基于蓝舌病（bluetongue,BT）的危害及RNA阳性质控品研制的重要性,试验将pTrcHis-MS2质粒借助点突变技术在噬菌体外壳蛋白15和16氨基酸之间插入组氨酸（His）蛋白标签,构建了pTrcMS载体。将pMD19-T-BTV质粒与pTrcMS质粒分别进行KpnⅠ和Hind Ⅲ双酶切,然后连接构建pTrcMS-BTV重组质粒。将pTrcMS-BTV重组菌进行原核表达,产物借助偶联His蛋白标签的磁珠捕获技术获得纯化的蓝舌病假病毒颗粒,进行特性鉴定并定量。结果显示,研制的pTrcMS-BTV物质经PCR方法评价纯度高,无基因DNA污染;透射电镜观察形态为不规则的直径约为26 nm的多边形;RT-PCR方法检测稳定性表明该物质耐RNase A,易保存;应用荧光RT-PCR检测表明该物质溶液最低检测限可达到2.5×10²拷贝/mL。蓝舌病假病毒物质将为蓝舌病分子生物学检测提供阳性质控物质。     

南非Ⅱ型口蹄疫主要抗原表位串联基因的表达及抗原性分析

在对南非Ⅱ型口蹄疫病毒抗原分析基础上,将已经筛选出的6条抗原性良好的多肽采用柔性linker拼接,人工合成相应核苷酸后连入T载体中。将酶切回收的串联基因(VP1-VP3)克隆于表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-VP1-VP3。该质粒转化于感受态细胞BL21(DE3) plysS中,经IPTG诱导后进行了可溶性分析和Western blotting分析,且对融合蛋白柱上酶切纯化后进行了抗原性分析。重组质粒pGEX-VP1-VP3的PCR和测序结果表明,VP1-VP3串联基因已成功插入pGEX-6p-1载体中;pGEX-VP1-VP3融合蛋白分子质量约为38.3 ku,并以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,该融合蛋白与南非Ⅱ型FMDV阳性血清能发生特异性反应;酶切纯化后蛋白间接ELISA鉴定结果表明,表达的VP1-VP3蛋白具有良好的免疫原性与反应原性。串联多肽的成功表达,将为南非型口蹄疫血清学检测方法建立奠定基础。     

南非Ⅱ型口蹄疫间接ELISA检测方法的建立

为满足口岸对南非Ⅱ型口蹄疫检测、监测的需求,在对南非Ⅱ型口蹄疫抗原表位分析及相关基因合成的基础上,进行融合蛋白pGEX-VP1~VP3的体外表达,采用柱上酶切方法制备VP1~VP3蛋白。将纯化VP1~VP3抗原包被96微孔板,分别优化抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度,确定阴性临界值。经反复优化,建立的南非Ⅱ型间接ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度为6.4ug/ml,血清最佳稀释度为1:200,酶标二抗最佳稀释度为1:4000,阴性临界值(OD450)为0.562。检测样品判定标准为:OD450>0.622为阳性,OD450<0.502为阴性,0.502≤OD450≤0.622为可疑。特异性试验结果表明,所建立方法与其它血清型口蹄疫间无交叉反应。南非Ⅱ型口蹄疫间接ELISA检测方法的建立为我国口岸口蹄疫检疫提供了新的查验方法。     

猪制品中非洲猪瘟病毒核酸提取方法的比较

为比较猪制品中非洲猪瘟病毒（ASFV）核酸提取效率,将非洲猪瘟假病毒掺入新鲜猪肉、香肠、血粉试验材料,制备相关模拟感染样品,然后采用核酸免抽提、柱式核酸提取及磁珠吸附核酸提取方法提取ASFV核酸,计算ASFV核酸回收率,评估提取效率。结果显示：猪制品模拟感染样品中,ASFV核酸在上清和沉淀中均被检出,且上清中的检出量高于沉淀;对于香肠模拟感染样品上清,3种核酸提取方法均适合,但以柱式提取方法为佳,病毒回收率高达82.8%;对于新鲜猪肉模拟感染样品上清,以磁珠吸附核酸提取方法为佳,病毒回收率为20.9%;对于血粉模拟感染样品上清,以柱式核酸提取方法为佳,病毒回收率为10.2%。本研究为不同猪制品中ASFV核酸提取提供了参考。     

施马伦贝格病焦磷酸测序检测方法的建立

为适应口岸施马伦贝格病快速、准确、高通量检测需求,建立一种基于RT-PCR及焦磷酸测序技术平台的施马伦贝格病检测方法。本研究针对施马伦贝格病毒基因组RNA的S、M和L三个基因节段保守区域利用焦磷酸测序软件PyroMark Q96ID分别设计RT-PCR扩增引物及焦磷酸测序引物,以人工合成的SBV重组质粒为模板分别建立了SBV S、M、L基因的PCR-焦磷酸测序检测方法,比较三基因的PCR扩增结果以及测序分析结果,结合特异性检测结果,最终确定以M基因作为靶基因建立的焦磷酸测序检测方法效果最好,并以德国FLI提供的SBV（BH80株）RNA对所建立的方法进行验证,通过对测得序列的比对分析可确定为施马伦贝格病毒,这表明本研究所建立的方法灵敏度高、稳定性好、特异性强,可以用于施马伦贝格病毒基因序列水平上的精准检测鉴定。