胆固醇转运蛋白NPC1L1的研究进展

NPC1L1是近年来人们研究高脂血症的重点内容,该蛋白已被证实在胆固醇的肠道吸收和胆汁分泌中发挥了关键作用。NPC1L1调节体内胆固醇的生物合成,是维持生物体胆固醇动态平衡的重要因素,同时也是新型降脂药物依泽替米贝的作用靶点。     

抗α毒素1D5单抗ScFv基因表达菌株生物学活性的研究

为研究抗A型魏氏梭菌α毒素ScFv蛋白的生物学功能,利用PCR技术克隆抗α毒素1D5单抗的ScFv基因,构建含ScFv基因表达质粒pHOG-1D5的重组表达菌株XL1-BLUE (pHOG-1D5)。酶切鉴定和序列分析证实构建的pHOG-1D5重组表达质粒含有ScFv基因,且基因序列和阅读框架正确。ELISA检测结果表明在重组菌株XL1-BLUE (pHOG-1D5)培养上清和细胞周质中均检测到目的蛋白。SDS-PAGE分析表明目的蛋白表达量占菌体总蛋白相对含量的29.2%。同时对ScFv蛋白生物学活性进行检测,结果表明其能中和α毒素的卵磷脂酶活性且能够对致死性腹腔攻击α毒素的小鼠产生良好的被动保护作用,从而为临床治疗α毒素中毒奠定了坚实基础。     

产气荚膜梭菌α毒素基因的定点突变与表达

选择可能影响α毒素生物活性的氨基酸相关碱基位点进行定点突变,构建α毒素基因的突变体并在大肠杆菌中表达。利用PCR定点突变技术,进行第68位组氨酸→亮氨酸的定点突变,构建含α毒素突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)pLys(pXMCPA02)。结果表明,α毒素突变基因第287位核苷酸由A→T,经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pXMCPA02含有α毒素突变基因,且基因序列和阅读框架正确;重组菌株BL21(DE3)pLys(pXMCPA02)表达产物经SDS-PAGE分析,其表达量占菌体总蛋白相对含量的33.82%。因此,已成功构建了α毒素基因突变体,并实现了在重组大肠杆菌中的表达。     

胆固醇转运蛋白NPCIL1的研究进展

NPCIL1是近年来人们研究高脂血症的重点内容，该蛋白已被证实在胆固醇的肠道吸收和胆汁分泌中发挥了关键作用。NPCIL1调节体内胆固醇的生物合成，是维持生物体胆回醇动态平衡的重要因素，同时也是新型降脂药物依泽替米贝的作用靶点。     

魏氏梭菌α毒素分子生物学研究进展

魏氏梭菌是引起各种坏死性肠炎、肠毒血症,同时也是引起创伤性气性坏疽以及人类食物中毒的主要病原菌之一,其致病因子是该菌产生的外毒素。根据主要致病的毒素α、β、ε和ι,将该菌分为A、B、C、D、E 5个毒素型。各型魏氏梭菌均产生α毒素,它是魏氏梭菌最主要的毒力因子。α毒素是依赖锌离子的磷脂酶C,具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性。     

大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B融合基因表达条件的优化

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含K88ac-ST1-LTB融合基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下K88ac-ST1-LTB融合基因的表达情况。经酶切鉴定证实重组质粒pETXKSL3含有K88ac-ST1-LTB融合基因且阅读框架正确,同时以IPTG为诱导剂诱导K88ac-ST1-LTB融合基因表达并对其表达条件进行优化。优化表达的结果:培养基pH7.0,培养温度37℃,IPTG浓度1.0 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间3 h,此时K88ac-ST1-LTB融合蛋白表达量为35.2%。本文实现了K88ac-ST1-LTB融合基因的高效表达,并为大肠杆菌肠毒素三价基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。     

A型产气荚膜梭菌重组菌株BL21（DE3）

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含α毒素突变基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下α毒素突变基因的表达情况。经酶切鉴定证实重组质粒pXMCPA02含有α毒素突变基因且基因序列和阅读框架正确。同时以IPTG为诱导剂诱导α毒素突变基因表达并对其表达条件进行优化。优化表达的结果是：培养基pH7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5 h,此时重组菌株pXMCPA02蛋白表达量为35%。从而实现了α毒素突变基因的高效表达,为A型产气荚膜梭菌α毒素基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。     

重组人白细胞介素-15摇瓶生产工艺优化

通过研究不同类型培养基和培养温度、起始pH值等发酵条件对IL-15产量的影响,初步确认了摇瓶水平发酵各因素的最优条件。优化的发酵条件为发酵起始pH值7．0、培养温度37℃、乳糖诱导浓度1．5g／L、菌体生长密度OD600达到1．0时加入乳糖、诱导时间4h,此时IL-15产量达到最高水平,从而为IL-15批量生产奠定了良好的基础。     

A型魏氏梭菌α毒素羧基端蛋白基因表达与结构分析

利用PCR技术将α毒素羧基端基因CPA251-370克隆到pET-32a载体上,构建了重组表达质粒pXETCPA-C,酶切鉴定和序列分析证实其含有CPA251-370基因且序列和阅读框架均正确。对重组菌株BL21(DE3)(pXETCPA-C)表达的蛋白质进行SDS-PAGE分析,结果表明CPA251-370蛋白表达量占菌体总蛋白质相对含量的16.43%。SOPMA法预测表明CPA251-370蛋白二级结构主要由β折叠和无规则卷曲组成,其3D结构与α毒素羧基端部分相似。CPA和CPA251-370蛋白的圆二色(CD)光谱分析发现两者的CD光谱仅有一些微小变化。免疫攻毒试验表明CPA251-370蛋白免疫的小鼠能抵抗最小致死剂量(MLD) 0.5 mL·只~(-1)(活菌数约为5×10~9 cfu)的A型魏氏梭菌标准株C57-1毒素攻击。该研究深入阐释了A型魏氏梭菌α毒素的分子结构,为揭示其作用的分子机制奠定了坚实基础。