禽流感病毒HA基因在S2细胞中的表达与鉴定

根据GenBank中发表的禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)序列设计了1对引物并分别引入NotⅠ和NcoⅠ酶切位点,用PCR方法扩增AIV HA基因片段。回收目的基因片段,并用NotⅠ/NcoⅠ限制性内切酶消化,经纯化后,将其定向克隆入果蝇表达载体pMT/B/V5中,构建重组表达载体pMT-HA。测序验证正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,通过Blasticidin(杀稻瘟素)进行加压筛选,获得了抗性细胞S2-HA。提取S2-HA细胞的基因组DNA,PCR检测目的基因在果蝇S2细胞中的整合与表达。用终浓度500μmol/L的硫酸铜溶液诱导表达,收集无血清的细胞表达上清,样品浓缩后进行SDS-PAGE及Western Blotting检测。结果表明,成功构建了重组表达载体pMT-HA,转染细胞经10 mg/L的Blasticidin筛选及鉴定后获得了稳定表达HA的果蝇S2细胞株。     

中国巴马小型猪内源性反转录病毒的检测

目的 :对我国特有巴马小型猪内源性反转录病毒 ( porcine endogenous retrovirus,PERV)的存在与 m RNA的表达情况进行检测 ,了解巴马小型猪内源性反转录病毒的携带情况。方法 :根据以往建立的 PCR、RT-PCR检测方法 ,对来自于巴马小型猪外周血淋巴细胞的 DNA和RNA样品进行 PERV核心蛋白基因 ( gag)、多聚酶基因 ( pol)及囊膜基因 ( env)的存在与表达进行检测 ;同时 ,根据目前通用的 env基因分型方法检测 PERV env-A、env-B、env-C的存在与表达。结果 :在 1 2个被检的 DNA样品中均检出了PERV特异性 DNA的存在 ;同样 ,在 1 2个被检的 RNA样品中均有 PERV特异性 RNA的表达 ,且所表达的 PERV均为 A型和 B型 ;其中有9个 DNA样品检测出 PERV-C型的存在 ,所有样品中均未检出 C型 PERV的表达。结论 :检测结果表明 1 2个被检巴马小型猪基因组中存在着内源性反转录病毒序列 ,且能以 m RNA的形式表达 ,这一结果为我国特有小型猪的开发、利用及其病毒安全性评价奠定了基础。     

减蛋综合征病毒AA-2株适应体外培养的研究

在分离并系统鉴定了减蛋综合症病毒AA-2株的基础上，进行了该毒株的体外培养试验，以寻求适应于细胞培养物中继代的细胞适应毒。结果表明，AA-2毒株可在鸭胚成纤维细胞（DEF）、鸭胚肾细胞（DEK）、鸭胚肝细胞（DEL）、鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸡胚肾细胞（CEK）和鸡胚肝细胞（CEL）上增殖和继代，并随着继代次数的增加，CPE潜伏期缩短，持续期延长，半数细胞感染量（TCID50）呈逐代增加趋势，血凝效价（HA）逐代稳步增强，至第15代之后，之些变化趋于稳定。证明用鸭胚细胞培养的AA-2株病毒在PK-15，BHK-21，SP2/0等细胞中增殖的迹象。还较为系统的测定了第19代DEF毒的其它特性。发现在接毒后120小时，HA及TCID50值最高，细胞适应毒对鸭胚致死率为10%，比原毒降低23%，理化特性与原毒一致，且仍保持原毒的抗原性。     

猴B病毒通用核酸检测体系的建立与评价

建立能同时检测猴B病毒5种基因型的通用核酸检测体系,并对其进行方法学评价。首先,对猴B病毒5种基因型代表毒株全序列进行比对,选取其保守区域(g B基因)设计猴B病毒的通用引物和探针。其次,构建参考品质粒,并以其为模板建立核酸检测体系的标准曲线。最后,对该核酸检测体系分别进行特异性、通用性、敏感性和重复性评价。建立的标准曲线在3×107~3×102 copies模板范围内相关系数|r|=0.999。方法学评价结果显示,该核酸检测体系与人单纯疱疹病毒1型、人单纯疱疹病毒2型、水痘带状疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒均无交叉反应;可同时检测猴B病毒5种基因型,检测下限为30 copies;批内和批间实验重复性良好。建立的猴B病毒通用核酸检测体系对于疑似猴B病毒感染病例的辅助诊断,以及高质量实验猴群的建立均有着重要意义。     

禽类的轮状病毒感染

轮状病毒(rotavirus)与多种动物的腹泻有关,包括人、畜、鸡和鸟类。1977年,美国学者首先在幼火鸡的水样粪便和肠道内容物中发现了与轮状病毒的形态极为相似的病毒颗粒。以后英国、日本、意大利、北爱尔兰、比利时等国相继发表了有关轮状病毒感染家禽或其它鸟类的报告。我国用     

鸡贫血病病毒长春株VP3基因的克隆及序列分析

采用PCR扩增方法成功克隆了鸡贫血病病毒（CAV）长春分离株的VP3基因，并进行了核苷酸序列测定，通过与TK5803、SJ1株进行序列比较，发现长春分离株VP3基因与TK5803仅有1个碱基差异，而氨基酸序列完全相同，与山东SJ1株有3个碱基差异和3个氨基酸差异。     

花尾榛鸡传染性鼻炎

传染性鼻炎（IC）是由鸡副嗜血杆菌（Haemophilus paragallinarum）引起的鸡的一种急性呼吸道病,花尾榛鸡发生此病目前尚未见报道。1992年7月10日本所饲养的25～35日龄雏榛鸡发病48只,到7月20日为止共死亡20只,病死率达41.7％。经防治控制了本病的蔓延,现报道如下。1 临床症状 病鸡突然食欲降低,面部水肿,单侧或双侧眼睑肿胀,流泪,鼻道和鼻窦内有浆液粘液性分泌物,常甩头,呈严重呼吸困难。     

减蛋综合征病毒末端片段的克隆及细胞内DNA重组

采用９～１０日龄非免疫鸭胚增殖的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＡＡ－２毒株,经差速离心法浓缩纯化后,提取病毒基因组ＤＮＡ。采用碱变性法除去病毒基因组共价结合的末端蛋白（ＴＰ）。用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ水解纯化的ＥＤＳＶ基因组ＤＮＡ。经低熔点琼脂糖凝胶电泳后,回收Ｃ、Ｄ、Ｅ片段。克隆到ｐＵＣ１９载体的ＨｉｎｄⅢ和ＳｍａⅠ双酶切位点及ＨｉｎｄⅢ位点上,经蓝白斑筛选和单、双酶切鉴定,获得了ｐＵＨＣ、ｐＵＨＤ、ｐＵＨＥ重组质粒,其中ｐＵＨＣ含有末端片段。将ＥＤＳＶＳａｌⅠ水解产生并回收的大片段与ｐＵＨＣ在９５℃水浴中变性,６５℃复性后,用钙离子介导法,共转染５０％～７０％的单层鸭胚成纤维细胞,转染后３６ｈ开始产生细胞病变（ＣＰＥ）。４８ｈ后将病变细胞反复冻融,经尿囊腔接种９～１０日龄鸭胚,回收的尿囊液能凝集鸡红细胞,这种血凝性能被ＥＤＳＶ高免血清抑制,电镜下观察到腺病毒样颗粒。     

细小病毒感染的宿主特异性分子机理

宿主范围是病毒的基本特性之一,决定着动物或细胞对病毒感染的敏感性和特异性,也是病毒分子生物学和分子致病机理研究的重点和难点之一。细小病毒是感染动物和人的最小的DNA病毒,尽管某些病毒的基因组结构、核苷酸序列和衣壳蛋白(VP)极其相近,但往往具有极强的宿主特异性,甚至1