牛肠道病毒3D抗体与感染相关性研究

为了研究感染牛肠道病毒后非结构蛋白3D的抗体消长规律,试验从牛肠道病毒HLJ-3531株中扩增3D基因,将其克隆至表达载体pET-30a并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达,以Ni-NTA柱亲和层析法纯化得到的重组3D蛋白为抗原制备3D多克隆抗体,随后建立3D-ELISA方法用于检测HLJ-3531毒株感染小鼠后的3D抗体消长规律,同时用RT-PCR方法检测感染时期小鼠体内病毒核酸。结果表明:RT-PCR技术可检测出病毒出现的时间范围与3D抗体存在的时间范围符合性良好。说明3D-ELISA配合核酸检测方法有很高的概率检测出病毒感染活动期动物。     

携带AIV HA基因鸭肠炎病毒转移载体的构建

为了获得携带禽流感病毒(AIV)HA基因鸭肠炎病毒转移载体,试验采用基因工程方法构建了带有CMV启动子、多克隆位点(MCS)及牛生长因子转录终止信号和加poly(A)信号(BGHpA)等真核表达元件的载体pET-3.1,将H5N1亚型禽流感病毒HA基因插入pET-3.1,再将携带真核表达元件的HA基因插入鸭肠炎病毒通用...     

表达鹅副粘病毒F基因的禽痘重组病毒构建

本研究利用基因重组技术构建含有鹅副粘病毒(GPMV)主要保护性抗原F基因和LacZ报告基因的重组禽痘病毒转移载体;利用脂质体介导的方法将所构建的转移载体转染禽痘病毒(FPV)017株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝白筛选获得重组病毒;Western blot和间接免疫荧光试验结果显示重组禽痘病毒中F基因在CEF中获得表达,并且表达产物具有良好的反应原性;本研究为进一步的研究重组禽痘病毒的免疫保护性奠定了基础.     

马耳它布氏杆菌bp26基因缺失株的构建及鉴定

为了建立马耳他布氏杆菌M5-90株弱毒疫苗株与野生株的鉴别诊断,本研究以bp26基因作为重组靶位点,以M5-90为亲本,利用bp26基因ORF外侧序列作为同源序列,将卡那霉素抗性基因(Kan')整合到细菌基因组中,双交叉重组阳性菌株,经SDS-PAGE和western blot试验表明迁移率约为29 ku的BP26蛋白在亲本菌中表达并可被鼠抗BP26高免血清识别,而突变株M5-90-26反应结果为阴性,表明BP26蛋白在突变疫苗株M5-90-26中未表达.M5-90-26具备从血清学角度区分M5-90-26免疫与野生型布氏杆菌感染,对布氏杆菌病防制、监测及净化具有重要的意义.     

鸭肠炎病毒SORF3基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

以鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增获得SORF3(S3)基因,在pET-32a(+)/Rosetta(DE3)pLys系统中原核表达。S3重组蛋白经IPTG诱导,SDS-PAGE分析显示外源基因以包涵体形式表达为主,分子质量约为52ku。重组蛋白经Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,琼脂扩散法测得抗体效价为1:4。经Western blotting分析制备的多克隆抗体具有较高的特异性,间接免疫荧光试验证实制备的多克隆抗体与DEV的SORF3编码产物反应性良好,为进一步研究DEVSORF3结构与功能特性奠定了基础。     

Asia1型FMDV非结构蛋白3A基因的克隆、表达与抗原性鉴定

为了研究Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A的抗原性,试验对Asia1型口蹄疫病毒非结构蛋白3A基因进行扩增、亚克隆及测序,将3A克隆至表达载体pET-32a(+)中,选取阳性克隆转化Rosetta(DE3)pLysS大肠杆菌感受态细胞,用IPTG诱导表达和纯化3A蛋白,并进行SDS-PAGE鉴定与Western-blot分析。结果表明:在大肠杆菌中成功地表达了3A蛋白,表达的目的蛋白能与Asia1型FMDV阳性血清发生特异性反应。说明非结构蛋白3A具有较好的抗原活性。     

鸭肠炎病毒感染鸭外周血淋巴细胞变化研究

为了研究鸭肠炎病毒感染鸭外周血淋巴细胞的变化趋势,建立了检测鸭外周血淋巴细胞转化的MTS方法,利用该方法检测DEV免疫鸭外周血淋巴细胞变化趋势。结果表明,抗原特异性外周血淋巴细胞转化能力从末次免疫后可持续上升近4周达到高峰,以后快速回落。研究证实MTS法可有效检测鸭抗原特异性外周血淋巴细胞增殖情况。     

鹅细小病毒VP3蛋白B细胞线性表位的精确定位

本试验旨在利用获得的4株抗鹅细小病毒(GPV)VP3的单克隆抗体,进一步对GPV VP3 B细胞线性抗原表位精确定位。根据笔者实验室已鉴定的线性抗原表位区结果,筛选出单抗所针对的优势抗原表位区。设计并合成互相重叠5 aa的10 aa短肽寡聚核酸片段,退火后,连入pET-32a载体,经转化鉴定,诱导表达后,获得相应的小片段融合蛋白,并利用单抗通过Western blot进行抗原性鉴定。同样方法进行短肽片段两端氨基酸的逐个缺失设计,进一步精确定位,结果鉴定出2个抗原表位,分别为430-435 aa和643-647 aa。     

茨城病病毒S7基因的截短表达及间接ELISA检测方法的建立

为建立以茨城病病毒(IBAV)VP7蛋白为诊断抗原的茨城病(IBAD)血清学检测方法,本研究克隆了VP7蛋白抗原性、亲水性较强部分的编码基因,并在原核表达系统中表达了可溶性截短VP7蛋白。用截短VP7蛋白建立了IBAV间接ELISA检测方法。确定的阳性血清的判定标准为不低于0.32。特异性试验表明建立的ELISA方法可以特异性检测IBAV阳性血清。建立的ELISA方法与中和试验结果比较,符合率为77%。用建立的ELISA方法检测70份来自云南的牛血清样品进行检测,IBAV血清阳性率为45.7%。该方法的建立为IBAD的诊断提供了一种简单快速的辅助手段。     

鸭抗鹅细小病毒抗血清的制备

为了研究鸭抗鹅细小病毒抗血清对鹅细小病毒病的防治效果,试验采用鹅细小病毒98E株鹅胚胚毒(活毒)免疫成年鸭,检测其抗体效价和并描绘抗体消长规律,利用琼扩效价为1∶32的鸭抗鹅细小病毒抗血清进行鹅细小病毒病预防和治疗试验。结果表明:首免第1周即可在血清中检测到抗体,加强免疫后第1周血清抗体琼扩效价即达到1∶128;攻毒后第25天,在预防试验中雏鹅死亡率为0,在治疗试验中雏鹅死亡率为56%。说明鸭抗鹅细小病毒抗血清对雏鹅细小病毒病的防治具有很好的效果。