猪瘟DNA疫苗的临床免疫实验

在前期研究工作筛选出2种DNA疫苗质粒的基础上,采用3种免疫策略(DNA疫苗单独免疫法、DNA疫苗初免蛋白免疫加强的prime-boost方法以及沙门氏菌(Salmonella)载体介导法),于某规模化猪场对猪瘟病毒(CSFV)的DNA免疫效果进行了临床应用研究。随机选择未经猪瘟疫苗免疫的断奶仔猪60头,分6组进行免疫接种,检测免疫猪抗体产生情况并对各组免疫猪进行攻毒试验。免疫猪血清抗体ELISA检测结果表明,pcDSW组、pIRE2IL2组、pcDSW E2protein组和pIRE2IL2 E2protein组均产生了较高的抗体水平,而沙门氏菌介导的2种DNA疫苗质粒诱导的抗体水平不显著。攻毒试验结果表明,pcDSW和pIRE2IL2单独免疫组或prime-boost组能够抵抗致死剂量的CSFV石门强毒攻击,保护率87.50%￣90.00%。其中pcDSW效果好于pIRE2IL2。而沙门氏菌介导的DNA疫苗组不能产生有效保护。不同接种途径的免疫效果比较结果表明,颈部肌肉注射免疫后产生的抗体水平较后肢胫前肌注射免疫产生的抗体水平高。     

狂犬病病毒SRV9克隆株核蛋白基因的克隆、表达与特性分析

根据已发表的狂犬病病毒核蛋白基因序列，设计并合成了一对引物，从SAD株驯化的SRV9。蚀斑株中提取病毒RNA，通过RT-PCR扩增出核蛋白的全长cDNA序列，测序结果显示，其序列与国外报道的SAD母源株序列一致。将核蛋白的cDNA克隆至原核表达载体pET-28b( )中，转化大肠杆菌BL21（DE3）plyss，于30℃1mmol/LIPTG条件下诱导表达，大肠杆菌菌体裂解产物经SDS-PAGE分析，在分子量约为56kDa处出现一新的蛋白带。和预期的目的蛋白分子量相符，Western-blotting检测表明，表达产物能与狂犬病病毒阳性血清发生特异性反应，出现单一反应带，扫描分析显示，表达产物占菌体总蛋白的23%，包涵体分离，纯化后，纯度达89%，上述结果为核蛋白在狂犬病基因免疫和免疫检测中的进一步应用奠定了基础。     

我国狂犬病流行现状及原因

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种严重侵害大脑中枢神经的重要人畜共患传染病,死亡率几乎100%.野生动物是本病原的自然储存宿主,带毒犬是人狂犬病的主要传播来源.在发展中国家,特别是我国,95%以上的人狂犬病由带毒犬传染.     

轮状病毒VP4基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从轮状病毒感染的细胞中扩增了816bp的VP4片段中抗原表位区.通过T4 DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上,转化至受体菌DH5α中.提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定,证明重组质粒pT-V4中含有轮状病毒的VP4基因片段.经核苷酸序列分析,表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4基因中抗原表位区.     

T7 RNA多聚酶基因的克隆、序列测定及其在E.coli中的表达

从BL21(DE3)E．coli菌株中以PCR的方法扩增得到了与T7RNA多聚酶(T7RNApolymerase，T7pol)基因大小一致的DNA片断。将PCR产物纯化后直接克隆到pGEM—T载体中，经酶切鉴定和DNA序列分析表明克隆得到了正确的T7pol基因。将T7pol基因亚克隆入pET-28b( )中，构建得到原核表达质粒pET28T7。该质粒的BL21(DE3)pLysS转化菌在IPTG的诱导下可表达约98800的蛋白，这与T7pol的相对分子质量一致。将该质粒转化DH5α、JMl09、HBl01、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS等5种不同的宿主菌，仅有转化T7pol酶活性受到抑制的宿主菌BL21(DE3)pLysS才能得到转化子，而其余4种T7T7pol酶活性不受抑制的E．coli宿主菌不能得到转化子。pET28T7原核表达质粒这种仅能在T7pol酶活性受到抑制的宿主菌中才能存活的现象说明本试验所克隆的T7pol基因能正确表达出具有RNA转录酶活性的蛋白。     

一起猪瘟与牛病毒性腹泻混合感染猪的报道

猪瘟病毒 ( HCV)和牛病毒性腹泻病毒( BVDV)同属黄病毒科瘟病毒属成员。猪瘟是我国猪的最重要传染病之一。近些年来 ,其流行特点出现新的变化 ,以温和型、母猪繁殖障碍及新生仔猪死亡的猪瘟为多见 ,常发生于“免疫”猪群 ,呈现免疫失败现象。牛病毒性腹泻病毒除了引起牛发生黏膜性腹泻外 ,还可引起羊、鹿、猪及许多野生动物感染。一般情况下 ,猪感染 BVDV不表现牛病毒性腹泻的临床症状而呈现亚临床感染 ,其症状和病理变化类似温和型猪瘟。我国自 1 981— 1 987年在全国 2 9个省市共查出阳性牛血清 8万多头份 ,表明 BVDV已遍及全国。因…     

JEV、PPV、PRRSV、PRV多联PCR的应用研究

用 JEV、PRRSV二联 PCR,PPV、PRV二联 PCR以及这 4种病毒 4联 PCR对来自内蒙、广州、广西、天津、北京、吉林病料进行检测 ,共检了 1 4 6份病料。其中 PRRSV阳性 7份 ,PPV阳性 1 2份 ,PRV阳性 2 1份 ,PRV和 PPV混合感染 4份。并对 5份人工接种 JEV小鼠病料检测 ,其中 4份为阳性。随后对部分阳性 PCR扩增产物进行点杂交和核苷酸测序鉴定 ,证实了 PCR扩增准确性。对内蒙 PRRSV阳性扩增带测序结果显示 ,我国流行 PRRSV为美洲型 ,在扩增片段的核苷酸序列上有 3个碱基差异     

疑似猪瘟病例中猪瘟病毒与伪狂犬病病毒的分离与鉴定

猪瘟和猪伪狂犬病均为OIE规定的通报疫病.引起猪瘟的猪瘟病毒为RNA病毒,属于黄病毒科瘟病毒属成员,伪狂犬病病毒是疱疹病毒科的DNA病毒.母猪感染猪瘟病毒或伪狂犬病病毒后都会引起流产,产下弱胎死胎,成为病毒传播的重要来源,为猪场疫病防控带来很大难度.近年来我国有这两种病毒混合感染报道[1-2],并未分离到病毒.我们在对1份母猪猪瘟阳性病料进行猪瘟病毒分离时,同时分离出1株致细胞病变的病毒,终鉴定该病毒为伪狂犬病病毒.本试验从同一份病料中成功分离到这两种病毒,为猪瘟、伪狂犬病病毒混合感染报道提供了有力佐证.     

猪瘟病毒广西地方流行株GX-3/98的致病性及其与兔化弱毒株的免疫相关性

从广西南宁某猪场分离1株病毒（GX-3/98）,通过RT-PCR扩增出猪瘟病毒约250 bp的E2基因主要抗原编码区,与猪瘟石门系强毒株及兔化弱毒株核苷酸序列同源性分别为80.6%和81.1%,属于基因Ⅱ群,subgroup 2.1亚型。该毒株经本动物传3代,均不表现典型的猪瘟临床症状。用猪瘟兔化弱毒疫苗免疫后,以此分离病毒攻毒,进行免疫保护相关试验,结果免疫组100%（2/2）获得保护,且在攻毒前、后扁桃体HCFA检测均为阴性。对照组（非免疫猪）攻毒后50%（1/2）死亡,另1头猪耐过。扁桃体HCFA检测,于攻毒后1周开始出现阳性结果,且一直持续到猪死亡的第79天。本试验结果初步表明,我国现行使用的猪瘟兔化弱毒苗对目前猪瘟病毒流行毒株仍具有良好的保护力。GX-3/98流行株为1株毒力较低的猪瘟病毒,能够长时间散毒。     

牛病毒性腹泻病毒P125基因重要区的比较与分析

根据牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）ＮＡＤＬ株的序列，以计算机辅助设计，化学合成１对引物（Ｗ１／Ｗ２）；应用ＲＴ－ＰＣＲ对国内不同地区分离的４株ＢＶＤＶ的Ｐ１２５基因外源序列插入区进行了扩增，并将扩增的片段进行克隆和序列测定，同时以ＤＮＡＳＩＳ和ＰＲＯＳＩＳ计算机软件将测定的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较分析。结果证实，国内分离的４株ＢＶＤＶ在这一区域中既没有外源序列的插入，也没有基因重组、基因重排或基因缺失，但存在某些核苷酸和氨基酸的替换，表明病毒的致细胞病变作用除与外源序列的插入、基因重组、基因重排或基因缺失有关外，可能还存在其他机制。核苷酸序列的同源性及系统树分析的结果表明，国内的ＢＶＤＶ毒株存在Ｉａ和Ｉｂ２个基因亚型，它们均属基因Ｉ型ＢＶＤＶ