广东台山2012—2013年鳗鱼药残监测分析

广东台山是我国最大的鳗鱼养殖基地,其鳗鱼产品以出口为主,如活鳗的出口量约占全国活鳗总出口量的80%。药残是影响出口鳗鱼的主要因素,本研究采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)和气相色谱-质谱法(GC-MS),对台山鳗鱼产品可能含有的100种药物残留做了两年的连续跟踪监测,结果表明,台山鳗鱼养殖业发展平稳,具有养殖科学、管理完善、用药合理、监管到位,养殖场用药少,疫病发生率低等特点。     

利用类病毒脂质体抗原检测H5N1亚型禽流感病毒抗体ELISA方法的建立

利用昆虫杆状病毒表达系统制备了H5N1亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白、类病毒脂质体和病毒样颗粒,分别作为包被抗原,建立了相应的检测H5N1亚型禽流感病毒抗体的ELISA方法。特异性试验、敏感性试验、重复性试验和稳定性试验结果表明,利用3种抗原包被所建立的ELISA方法均具有良好的重复性和稳定性,批间和批内变异系数均小于10%,但单独表达的HA蛋白和类病毒脂质体特异性更好,而且类病毒脂质体有更高的免疫反应性,与灭活全病毒相比安全性更高,故在H5N1亚型AIV抗体水平检测方面更具有应用前景。     

禽败血支原体病的预防与控制

禽败血支原体病主要是指鸡或者火鸡的一种慢性呼吸道传染病。１病原迄今为止确认对鸡致病的支原体仅有三种:一是引起鸡的慢性呼吸道病和火鸡的传染性鼻窦炎的禽败血支原体（ＭｙｃｏｐｌａｓｍａＧａｌｌｉｓｅｐｔｉｕｍ，ＭＧ）;二是引起鸡和火鸡亚临床或临床感染的滑液膜支原体（ＭｙｃｏｐｌａｓｍａＳｙｎｏｖｉａｅ，ＭＳ）;三是引起火鸡气囊炎的火鸡支原体（ＭｙｃｏｐｌａｓｍａＭｅｌｅａｇｒｉｄｅｓ，ＭＭ）。鸡败血支原体一般为球形、卵圆形,有时为棒状或球杆状,大小约为０．２～０．５μｍ,利用瑞氏染色液或姬姆萨染色液染色时…     

微量补体结合试验检测牛、羊副结核病的研究

采用《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》“副结核病补体结合试验操作规程”方法(简称常量法)和微量补体结合试验(简称微量法)检测3677头进口牛羊的副结核病抗体并进行比较。结果表明，常量法和微量法的溶血素效价测定值相同，补体效价测定值近似，阴性血清对照、抗原对照、补体对照、红细胞对照、血清抗补体结合对照结果均相同，阳性对照血清效价微量法比常量法提高1个滴度，被检血清的阳性检出率微量法高于常量法。比较37℃水浴及37℃恒温培养箱环境下的微量法补体结合试验结果，溶血素效价、补体效价、各项对照试验结果完全相同，被检血清在37℃水浴反应更加充分。比较用变态试验和补体结合试验检验3677头牛羊副结核病的结果、以及用补体结合试验、变态反应和酶联免疫吸附试验方法同时检测2024头牛的结果，发现它们的相关性很小。     

用地高辛标记的PCR－ELISA技术快速检测转基因鱼

取含有小鼠重金属螯合蛋白（mMT)基因启动子及人生长激素（hGH)基因的鱼样品，以Qiagene核酸纯化技术对鱼组织DNA进行纯化。常规PCR检测显示，mMT启动基因和hGH基因的PCR产物分别为240bp和130bp，与设计相符。PCR产物的核酸测序结果证实其扩增产物具特异性。地高辛-PCR（Dig-PCR)标记反应显示，2个基因均产生1条Dig标记的特异产物带。Dig-PCR-ELISA检测敏感性试验显示，对mMT启动子和hGH基因的检测敏感性可达10^-3，与常规PCR结合琼脂糖胶电泳检测方法相比，检测敏感性可提高至100-1000倍。试验证明，针对mMT和hGH基因所建立的Dig-PCR-ELISA技术特异可靠。     

副猪嗜血杆菌环介导等温扩增检测方法的建立

本研究旨在建立检测副猪嗜血杆菌(Hps)的新方法。根据GenBank上发表的不同血清型Hps的16S rRNA序列,找出高度保守区域,再针对该区域设计了4条特异性引物,建立了Hps环介导等温扩增法(LAMP)。试验结果表明,LAMP方法在恒温(63℃)条件下特异性强,比PCR方法敏感100倍,鉴于目前副猪嗜血杆菌分离培养和鉴定的复杂性,LAMP操作简单、成本低,整个扩增反应在1 h内即可完成,为检测Hps提供了一个快速简便的分子生物学方法。     

猪瘟病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

本研究设计了4条针对猪瘟病毒6个位点的特异性引物,建立了一种灵敏、特异、快速的猪瘟病毒体外等温扩增(RT-LAMP)检测方法,所建立的方法能够特异地检测出猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)的存在,检测PRV、PRRSV、PCV-2等病毒均为阴性;灵敏度高,所建立的CSFV-RT-LAMP方法灵敏度为10-5,总RNA的检测阈值约为1pg;反应快速,整个扩增反应可在1h内完成;操作简单,不需要PCR仪等复杂的仪器,结果可经肉眼观察及电泳检测。本试验为猪瘟的现场快速检测提供更加简便、快速的方法,可以满足基层检疫的需要。     

猪圆环病毒Ⅰ型荧光定量PCR检测方法的建立

以定量的10倍系列稀释的质量pMD-ORF2为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了PCV1检测的荧光定量PCR方法.结果表明该方法检测灵敏度可达1.0×104拷贝/μL,线性范围为1010～101;对起始浓度为1.0X107、1.0×106、1.0×106拷贝/μL的标准品的最终实际测得值分别为1.001×107、0.869×106和0.988×105拷贝/μL,变异系数分别为4.758%、1.865%和3.836%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR(nPCR)具有相近的灵敏度.     

水疱性口炎病毒RT-LAMP快速检测方法的研究

根据逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)原理,针对水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G基因序列中的6个区域设计内外各1对特异引物,建立扩增VSV糖蛋白(G)基因的RT-LAMP方法。扩增产物电泳呈特异的阶梯状条带分布,扩增产物加SYBR GREEN I染色呈特征性的黄绿色,肉眼可直接观察判定。同时,还建立了可以进行定量检测的实时RT-LAMP方法。特异性试验显示,本方法可快速检验鉴别VSV与口蹄疫病毒(FMDV)和猪水泡病病毒(SVDV)。敏感性试验显示,建立的实时RT-LAMP方法检测VSVRNA的最低检测量为0.01 PFU,比实时荧光RT-PCR显著提高。建立的LAMP方法可检测p-VSVNJ质粒DNA的最低量为6.36×10-3pg/μL(1.4×103copies/μL),比PCR也显著提高。综合表明,本研究建立RT-LAMP检测VSV的方法具有特异、敏感、快速、简便的特点,具有开发应用前景。     

多重PCR-变性高效液相色谱法快速检测结核致病菌群并同步鉴别致病菌种

本研究旨在运用多重PCR联合变性高效液相色谱(DHPLC)技术原理,建立快速检测人兽结核致病菌群并鉴别主要致病菌种的新方法。建立了四重PCR-DHPLC方法,可同时检测结核分枝杆菌复合群(MTC)特异的IS6110和IS1081插入序列、结核分枝杆菌特异结构基因和牛分枝杆菌特异结构基因共4个目标基因。采用13种分枝杆菌标准菌株和分离株以及23种常见微生物样品进行特异性试验,采用纯化标准菌株DNA以及克隆了扩增序列的重组质粒DNA进行检测灵敏度试验,采用从临床疑似发病牛群采集的牛组织样品进行临床检测试验,并与细菌分离培养方法进行比对。结果表明:所建立的多重PCR-DHPLC方法能特异检测MTC并准确鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌,而对其它11种分枝杆菌以及23种常见微生物样品均呈典型阴性检测结果;检测灵敏度达到每个反应102～103基因拷贝或3.6～6.8fg DNA模板浓度。采用该法从39份临床疑似样品中检出33份MTC阳性并检出其中28份为牛分枝杆菌阳性,而培养法检出21份阳性样品。采用该法临床检测全程可缩短至1d之内,其中对纯化DNA样品的检测分析可在2h内完成。本研究为人兽结核致病菌(群)的快速检测鉴别提供了新型分子生物学方法,所建立的四重PCR-DHPLC方法能实现快速检测结核分枝杆菌复合群并鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌