10种猪常见病毒基因芯片检测方法的建立及初步应用

旨在建立一种可同步检测猪10种常见疫病病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)、猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)、猪巨细胞病毒(porcine cytomegalovirus,PCMV)和口蹄疫病毒(food-and-mouth disease virus,FMDV)的基因芯片检测技术,为临床病料的初步诊断及流行病学调查提供一个新的可靠方法。对10种病毒基因的序列进行分析,设计引物对靶基因进行PCR扩增,将纯化后的靶基因点制成芯片,通过Cy3标记特异性引物扩增病毒得到具有荧光标记的探针,然后与芯片进行杂交,扫描分析结果,建立其基因芯片检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行检测。应用建立的基因芯片检测方法和普通PCR/RT-PCR方法对1 006份样品进行符合检测。试验结果表明,基因芯片检测10种病毒特异性好、灵敏度高,最低检测限度可达10~(5 )copies·μL~(-1),检测中,基因芯片与普通PCR/RT-PCR对1 006份临床样品的检测符合率为96.79%以上。初步研究表明,该基因芯片技术可同时同步检测10种猪疫病病毒,可应用于临床病料的初步诊断。     

花生黄曲霉生长预测模型的研究

通过对分离自花生的黄曲霉LYYSS03-3在不同温度(15-35℃)、不同相对湿度(水活度分别为0.5,0.7,0.9)下的菌落生长特性进行检测,采用Boltzmann和Logistic 模型对黄曲霉的生长曲线进行拟合,结果表明,在适宜温湿度阶段,花生黄曲霉的生长曲线更适合用Boltzmann模型拟合.     

云南红豆杉内生菌的分离及拮抗植物病害菌的筛选

[目的]为从与红豆杉共生的内生菌或其代谢物中寻找其他新型防治植物病虫害药物提供基础依据。[方法]以云南红豆杉为试验材料，从其根、茎、叶中分离内生菌；以棉花枯萎病、小麦赤霉病、番茄叶霉病等11种病原真菌作为供试菌株，研究红豆杉内生菌的抗菌活性，从中筛选出有较高抗菌活性的内生菌。[结果]从云南红豆杉根、茎、叶中分离出内生菌152株，其中细菌80株，真菌48株，放线菌24株；从中筛选出了有较高抗菌活性的11株内生细菌、5株内生放线菌和3株内生真菌，分别占分离得到的内生细菌、内生放线菌和内生真菌总数的13．75％、37．50％和20．83％。[结论]云南红豆杉组织内存在丰富的内生菌，不同组织内生菌的数量、种类有一定差异，在具有抑菌活性的菌物中，放线菌占的比例最高。     

烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv. tabaci)对烟草细胞内5种防御酶系统的影响

定期测定了感病品种红花大金元接种烟草野火病菌后叶片内5种酶活性的动态变化，研究结果表明：烟草接种病菌后，SOD活性先上升，后在8d下降，低于对照；POD活性接种后在1d略低于对照，后上升较快，10d达到高峰，此后一直高于对照；PPO活性在接种后1d低于对照15.8%，但此后上升，16d达到高峰，18d下降低于对照；CAT活性变化与POD相似，接种1d低于对照，但此后一直高于对照，并于6d达到高峰，10d虽有所下降，但接着升高；PAL活性与CAT、POD变化相似，接种后1d活性低于对照28.3%，其后上升，10d达到高峰，是对照的2.11倍，并维持较高的水平。     

牙鲆脑中促性腺激素释放激素受体的克隆和鉴定

GnRH（gonadotropin-releasing hormone）是下丘脑-垂体-性腺轴中重要的十肽信息分子，在所有的脊椎动物的生殖神经内分泌调控中具有重要的作用。GnRH成熟的十肽沿着轴突被运送到下丘脑正中隆起（median eminence）末端，然后进入下丘脑垂体门脉循环（hypothalamo hypophyseal portal circulation）（四足动物）或直接通过轴突末梢（大多数硬骨鱼）把信号传递给刺激性腺的细胞，与特异性受体结合，刺激促性腺激素（GtHs，gonadotropins）的合成与释放，参与脊椎动物繁殖的起始和维持正常生殖功能。伴随着GnRH的研究，研究者对鱼类GnRH受体的研究也越来越感兴趣，牙鲆（Paralichthys olivaceus）是中国重要的海水养殖鱼类，本研究从牙鲆脑组织中克隆得到全长的Type Ⅰ GnRH受体，并对其组织特异性表达作了分析，为牙鲆的神经生殖内分泌研究奠定了一定的基础。 在本研究中，以海水养殖牙鲆为材料，从牙鲆脑组织中采用巢式PCR、5′-和3′-RACE技术克隆得到了1671bp牙鲆促性腺激素释放激素受体（GnRH-R）全长cDNA序列，包括147bp的5′-UTR、1248bp的开放阅读框和276bp的3′-UTR，GenBank登录号是DQ011872。牙鲆GnRH-R和其他物种GnRH-R的氨基酸序列的多序列比对结果显示，其存在许多保守的特征，牙鲆GnRH-R显示有3个主要的功能区域：1个N端胞外结构域（1～44个氨基酸残基）、1个大的跨膜结构域（45～324个氨基酸残基）和1个C端细胞质区域（325～415个氨基酸残基）。空间结构预测显示牙鲆GnRH-R跨膜区域包含7个高度保守的跨膜α螺旋（45—64、76—95、114—135、156—176、207—224、267—286、305—324），这些α螺旋是受体锚定到细胞膜上必需的。 氨基酸序列系统进化分析表明，牙鲆GnRH-R与琥珀鱼GnRH-R1具有高度同源性（85％同源性）。已知的硬骨鱼GnRH—R基因的系统进化分析表明，存在两种类型的GnRH-R基因：Type Ⅰ GnRH—R和Tpye Ⅱ GnRH-R基因。在牙鲆GnRH—R的氨基酸序列中，具有Type Ⅰ GnRH—R共有的典型基序：CAFVT（TMⅢ）和DlLEGKVSHSLTH（TMⅦ开始的序列处），表明克隆得到的牙鲆GnRH-R属于Type Ⅰ GnRH—R。 GnRH-R跨膜α螺旋之间的区域形成了胞内或胞外loops，这些区域参与受体信号转导和肽选择性功能上。牙鲆GnRH-R在TMⅢ的细胞质边界处具有一个保守的DRQSA／（DRXXXI／V）基序，这个基序被认为参与G蛋白偶联信号转导和GnRH肽诱导受体的激活；另一个保守的区域是位于TMⅦ内的NPXXY或DPXXY基序同样存在于牙鲆中（DPVIY），这个基序参与到一些GPCRs（包括GnRH-R）的内在化（internalization），同时这个基序特别是基序中的Tyr残基对于受体激活和信号转导起到关键作用。在第三个胞内loop中，鱼类GnRH—R有个保守的Ala残基（在牙鲆中为Ala^250），其也在G蛋白偶联和受体内在化方面具有重要作用。 在哺乳动物或非哺乳动物GnRH-R中，在第一个和第二个胞外loop之间由2个Cys形成1个保守二硫桥，是受体的正确折叠必需的。和其他的GnRH-R一样，牙鲆GnRH-R在第一个和第二个胞外loop之间存在由2个Cys（Cys^112和Cys^190）可以形成的潜在的二硫桥。这个二硫桥的完全缺失将会影响受体的结构完整性和降低鱼类GnRH—R对GnRH肽的选择性。 GnRH-Rs的NH2-末端区域不是很保守，但含有糖基化位点，是GnRH—Rs表达、GnRH—Rs穿梭到细胞胞表面或受体稳定必需的。将mouse的GnRH—R糖基化位点引进到人GnRH-R中，可以增加受体的数量，但不影响受体结合力或肽选择性。牙鲆Type Ⅰ GnRH—R中在NH2-末端含有3个潜在的糖基化位点（N^11SSW、N^15GSS和N^22WTA），此外，在第一个胞外loop和第二个胞外loop中分别存在1个糖基化位点（N^100ITV和N^178VTI），牙鲆Type Ⅰ GnRH—R含有的糖基化位点比哺乳动物要多，牙鲆糖基化位点的数目是否／怎样影响牙鲆GnRH-R的表达、降解率或亲和力，应该进一步研究。 在牙鲆GnRH-R的第一个胞内Ioop中，存在1个和tGnRH-R Ⅲ基序（^80KRKSH^84）一致的基序（^69KRKSH^74），这个基序是Gs识别基序（BBXXB，B代表碱性氨基酸，X代表任何一种氨基酸）。已经证明这个基序和cAMP产生相关，cGnRH-Ⅱ能通过cAMP-PKA途径提高stbGnRH-R在COS7细胞中的活性。 和其他非哺乳动物GnRH-Rs相似，牙鲆GnRH-R含有1个C-末端细胞内尾巴。这种胞内尾巴是鱼类GnRH-Rs功能必需的，在第三个胞内loop中，牙鲆GnRH-R含有2个PKC磷酸化位点（^233SKR^235和^262TLK^264）；在C端尾巴中，存在1个PKC磷酸化位点（^402TAR^404）。牙鲆GnRH-RC-末端尾巴中含有鱼类GnRH-R具有的Src同源区3（SH3）结合区域（PxxP序列）（^340PPAP），能够潜在地传送偶联的能力到丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs），GnRH通过PKC和PKA调控GtHα和LHβ转录，二者都集中于MAPK水平。 RT—PCR分析表明，GnRH-R在牙鲆脑和垂体有表达，暗示牙鲆GnRH-R参与到生殖行为如产卵行为；RT-PCR也检测到牙鲆GnRH-R在卵巢和睾丸中有表达，其能与牙鲆cGnRH-Ⅱ和sbGnRH在卵巢中共表达，GnRH肽在卵巢中具有自分泌／旁分泌功能，对牙鲆卵巢中的GnRH受体可能起到调控作用。[中国水产科学，2006，13（4）：536—546]     

基于量子点的赭曲霉毒素AsFLISA检测技术研究

建立了基于量子点标记技术的赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)双抗夹心荧光免疫检测(sandwich fluorescence-linked immunosorbent assay,sFLISA)体系,包含多克隆包被抗体、生物素标记的多克隆检测抗体、量子点标记的链霉亲和素等,获得了sFLISA的最佳操作参数:包被抗体浓度2.5μg/mL,检测抗体稀释500倍,量子点标记链霉亲和素稀释100倍。该方法在OTA浓度3.125~125μg/L之间时,相对荧光强度和OTA浓度呈线性关系,回归方程为y=0.0206x+0.2018,R2=0.9924;加标回收率在90.1%~110.0%之间,变异系数均小于10%,能较好地进行赭曲霉毒素A的定量检测。     

大肠埃希氏菌O157:H7的HDA检测方法的建立

采用自行建立和优化的依赖解旋酶DNA恒温扩增(HDA)检测体系,建立HDA检测方法对大肠埃希氏菌O157:H7进行检测。采用大肠埃希氏菌O157:H7的rfbE基因为目的片段设计特异性引物,建成可快速检测大肠埃希氏菌O157:H7的HDA检测法,进行了特异性和灵敏度试验,并与普通PCR方法进行了比较。结果表明:所建立起的检测法,灵敏度为4.3×103 cfu·mL-1,灵敏度与普通PCR方法相当。大肠埃希氏菌O157:H7的依赖解旋酶DNA恒温扩增检测方法具有普通PCR的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,用普通水浴槽即可进行反应。具有广阔的推广前景。     

基于量子点标记技术的鸡新城疫病毒sFLISA检测技术研究

本研究建立了基于量子点的鸡新城疫病毒(NDV)sFLISA检测方法。该方法以抗NDV多克隆抗体为捕捉抗体、以生物素标记抗NDV单克隆抗体为检测抗体、以量子点标记的链霉亲和素为荧光探针。该方法与其它有关禽类病毒(产蛋下降综合征病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒)无交叉反应,比血凝试验灵敏,为临床早期快速检测NDV提供了行之有效的方法。     

动物源性肠球菌的分离鉴定及耐药性分析

了解肠球菌的耐药性,对控制该菌引起的感染,研制新一代抗菌药物具有重要价值。本试验从84种样品中分离鉴定出69株肠球菌,通过抗生素耐药性试验,发现肠球菌对多数抗生素表现出不同程度的耐药性,如青霉素耐药达52.2%、四环素达71.0%、万古霉素达85.5%。本文对肠球菌的分离与鉴定,药敏试验及风险分析三个方面作了分析和阐述。     

病毒性出血性败血症病毒N基因的病毒样颗粒制备及定值

为制备含有病毒性出血性败血症病毒(VHSV)N基因的RNA病毒样颗粒标准样品,通过RT-RCR扩增VHSV的N基因,将其克隆至含有组氨酸标签的pNH-MS_2his载体中,构建重组原核表达载体pNHMS_2his-N;将重组质粒pNH-MS_2his-N转化至表达菌株BL21(DE3),用1 mmol/L IPTG诱导表达、纯化;对病毒样颗粒进行鉴定及稳定性试验,使用数字PCR对病毒样颗粒进行定值。结果显示,该病毒样颗粒含VHSV N基因序列,并且稳定性良好,定值结果为8×10~6 copies/m L。结果表明,构建的病毒样颗粒可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品使用。