基因工程学课程三位一体实践教学体系的构建与实施

为适应现代社会对创新型人才的需求形势,基因工程学课程打破传统的教学模式,对课程结构进行疏理、整合和探索,加大了实践教学内容整合力度,构建"理论教学+课程实验+科研训练"三位一体实践教学体系。有利于学生理论联系实际,加强学生的实际操作能力、分析能力和综合能力的培养。既能让学生巩固提高和升华所学知识,又提高了分析问题和解决问题的能力,为今后其走向社会、开展业务工作打下良好的基础。     

犬新孢子虫可溶性抗原分析及间接ELISA检测方法的建立

新孢子虫病(Neosporiasis)是由犬新孢子虫(Neospra caninum)寄生于犬、牛、羊等多种哺乳动物细胞内而引起的一种原虫病[1-2].该病主要引起母畜的流产、死胎或新生胎儿的运动障碍和神经系统症状等,对牛的危害尤为严重,可垂直传播,带虫母牛可将虫体直接传给新生犊牛,已证实该病是造成养牛业严重经济损失的一个重要原因[1-3].     

牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

应用PCR方法扩增了牛瑟氏泰勒虫吉林株P33表面蛋白基因片段,并将扩增产物与pMD18-T载体连接,重组质粒经PCR、双酶切鉴定后测序;构建P33重组pGEX-4T-3表达载体,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达后.进行SDS-PAGE、免疫印记分析.结果显示,获得P33基因完整开放阅读框长868 bp,编码292个氨基酸,与中国株同源性为99.1%;表达的融合蛋白相对分子质量为59 000,能被牛瑟氏泰勒虫阳性血清识别,表明该融合蛋白具有较好的免疫原性.     

牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆与原核表达

本研究根据GenBank牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因设计1对引物,利用全血基因组DNA提取试剂盒提取牛瑟氏泰勒虫全血基因组DNA,PCR扩增得到了大小为786 bp的基因片断,测序分析证明,它与已报道序列的核苷酸同源性可达99%.将该基因与pET-28a(+)载体进行连接,经酶切和PCR鉴定,证明成功构建了含有目的基因片段的重组表达载体pET-28a-P33.将此质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,用IPTG进行诱导.结果证实,该基因在大肠杆菌中用IPTG诱导4 h时表达量达到高峰,表达产物为分子质量约30.3 ku的融合蛋白,其表达量占菌体总蛋白的43%,以包涵体形式存在;Western blotting试验证明,表达蛋白P33可被牛瑟氏泰勒虫阳性血清所识别,表明该融合蛋白具有较好的反应原性.     

不同佐剂对猪附红细胞体亚单位疫苗免疫效果的影响

为比较不同佐剂的猪附红细胞体亚单位疫苗的免疫效果,笔者通过试验提取猪附红细胞体抗原,并将其分别与白油佐剂、弗氏佐剂、明矾佐剂及铝胶佐剂混合,免疫小鼠。应用间接ELISA方法比较不同佐剂的猪附红细胞体亚单位疫苗的免疫效果。结果表明：白油佐剂组免疫效果最好,抗体水平在一周后有明显上升,其次为与弗氏佐剂组、铝胶佐剂组和明矾佐剂组。该试验为猪附红细胞体亚单位疫苗的研究提供了可靠的理论依据,为该病的防治奠定了一定的基础。     

PRRSVGP5蛋白原核表达载体的构建与鉴定

通过RT-PCR获得猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）CH-1a株GP5蛋白基因,克隆至pMDl8一T载体。经测序鉴定正确后,将该片段作为目的基因亚克隆至原核表达质粒pGEX-6p—1,构建原核重组质粒（pGEx—GPS）,转化至E．coli B1221感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示重组蛋白以包涵体形式得到了表达,Westernblot与间接ELISA试验分析表明,该蛋白与PRRSV阳性血清具有良好的免疫反应性。     

牛新孢子虫NcSAG1基因工程亚单位疫苗的免疫试验

为了解新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因工程亚单位疫苗对实验动物的免疫效果,本试验提取延边黄牛新孢子虫野毒株基因组DNA,用PCR技术扩增新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因,并在大肠杆菌中进行原核表达,将Western-blot鉴定具有免疫活性的重组蛋白与弗氏佐剂混合制备NcSAG1基因工程亚单位疫苗,免疫BALB/c小鼠,应用间接ELISA方法测定体液免疫水平,应用流式细胞技术测定细胞免疫水平,以此评价疫苗对实验动物的免疫应答反应。结果显示,制备的NcSAG1基因工程亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠后,在三免后第3天时,检测抗体的OD450nm值达0.688;CD4+/CD8+值达3.650,均显著高于重组蛋白免疫组和PBS对照组,说明制备的基因工程亚单位疫苗能够提高实验动物的体液免疫和细胞免疫水平。本试验为牛新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因工程亚单位疫苗的深入研究奠定了基础。     

弓形虫ROP4基因的克隆及原核表达载体的构建

弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种严重危害人类及家畜的机会性致病原虫,可侵犯除成熟红细胞以外的任何有核细胞,引起多种组织、器官病变和损害[1].近年来,国内外学者对弓形虫的研究已取得了一定进展.     

延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因的克隆与序列分析

为了解延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因特性,试验提取延边黄牛流产胎牛脑组织中犬新孢子虫DNA,应用PCR技术扩增延边黄牛犬新孢子虫NcSAG1基因,并将此基因克隆到pMD18-TSimple载体上,筛选获得重组质粒,然后转化到大肠杆菌感受态细胞中,对PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的菌株进行测序,用DNASIS序列分析软件将目的基因与已发表的核苷酸序列进行同源性比较分析。结果表明:克隆的基因片段长度为681 bp,编码226个氨基酸,与GenBank中发表的NcSAG1基因(AY113004)核苷酸序列同源性为99.7%。     

不同药物及给药途径对消灭牛体表寄生蜱的研究

消灭、控制传播媒介蜱是防治牛瑟氏泰勒虫病的关键．在蜱活动的季节中，畜体灭蜱更是直接保护牛只避免或减轻蜱危害的重要措施．以往畜体灭蜱的方法很多，如药浴、喷洒、浇泼、局部涂擦和手捉等，采用这些方法进行灭蜱麻烦、劳动强度大、药效期短，又常受到牧地条件所限制...