湖北省某县羊布鲁氏菌病群体血清流行率横断面研究

2015年初,湖北省某县启动羊布鲁氏菌病监测净化工作。为了解该县羊布鲁氏菌病的流行现状和阳性场户的地理分布,对该县1 567户养羊场户分两阶段抽样,采用虎红平板凝集和c ELISA垂直试验进行检测,获知该县羊布鲁氏菌病的群体血清流行率。结果显示:该县羊布鲁氏菌病真实群体血清流行率为2.00%,不同乡镇和不同养殖规模养羊场户的群体血清流行率分别在0~11.16%和0.67%~25.58%之间不等;检出布鲁氏菌病阳性场户74户,其分布在全县10个乡镇,主要集中在4个乡镇,以存栏量在50只以下的养羊场户居多;不同乡镇和不同养殖规模养羊场户中的布鲁氏菌病分布情况不同。调查结果提示,应根据本底调查结果,制订净化方案,实行布鲁氏菌病区域化管理,同时加强对不同流行区域间羊群移动的检疫监管。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp4的表达及其抗血清的制备

根据GenBank中已发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）HuN4株全基因组序列,设计合成一对引物,对PRRSV HuN4株非结构蛋白Nsp4（Nonstructural protein 4基因进行RT-PCR扩增,克隆到原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体pET30a-Nsp4,经酶切测序鉴定。将pET30a-Nsp4转化表达菌株BL21（DE3）,诱导可表达分子量约为27kDa重组蛋白。Westernblot显示其具有较好的反应原性,经镍离子亲和层析（Ni-NTA）纯化获得了高纯度的可溶性重组蛋白。将纯化的Nsp4蛋白免疫BALB／c小鼠,抗血清ELISA效价达1：16000,Western blot和IFA表明,所制备的抗血清能够特异性识别PRRSV自身表达的Nsp4蛋白。本研究获得了可溶性的PRRSV Nsp4蛋白,制备了Nsp4特异性多抗血清,为进一步研究Nsp4蛋白的亚细胞定位及功能奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒双基因多组合DNA疫苗的构建

本实验根据PRRSV结构蛋白的特性和IFNγ及IL-2这两种细胞因子的特性,构建表达PRRSVGP4-GP5、GP5-M、GP5-N、GP5-IFNγ、GP5-IL-2、N-IFNγ、N-IL-2的重组质粒。这些重组质粒在真核细胞中得到了表达。用这些真核表达质粒可以免疫小猪,通过检测其对猪体免疫应答的诱导能力和接种后动物对PRRSV的抵抗力来对基因疫苗的效能进行研究,以期筛选到有效的基因疫苗并为今后进一步的研究提供思路和理论基础。     

猪繁殖与呼吸综合征基因免疫的初步研究

将猪繁殖与呼吸综合征病毒的主要免疫蛋白基因ORF4和ORF5及ORF5和ORF7基因分别共同克隆到真核表达载体pIRES1neo中构建重组质粒,称为pIRESorf5/4和pIRESorf5/7。添加脂质体作为佐剂的表达质粒免疫BABL/c小鼠,经过三次免疫和采取血清,通过ELISA检测,其中pIRESorf5/7表达质粒产生较强的免疫应答,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒基因免疫应答以及研制基因疫苗奠定基础。     

致弱过程中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株部分生物学特性的研究

为了研制高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)弱毒疫苗,将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN4株进行了致弱驯化,在Marc-145细胞上对其进行了3次蚀斑克隆和连续传代.该毒株的病变速度随着代次增高逐渐加快,传至80代以后其病毒滴度达到最高并保持稳定;电镜观察发现低代次病毒粒子形态以棒状为主,高代次病毒粒子形态以球形为主;蚀斑形态比较发现低代次病毒形成的蚀斑大小不一,而高代次病毒形成的蚀斑大小均一;序列分析和病毒抗原性分析表明HuN4株传代过程中GP5蛋白羧基端1个主要抗原表位(196QWGRL200)发生突变即196Q突变为196R,针对该表位的单克隆抗体只与HuN4株低代次病毒反应而不与高代次病毒反应.以上结果表明:在Marc-145细胞上经蚀斑克隆和连续传代致使HP-PRRSV HuN4株部分生物学特性发生改变,这些特性的改变在病毒弱化过程中的作用还有待进一步的研究.     

我国猪群中TTV的鉴定及其分子流行病学分析

为了确定Torque teno virus(TTV)在我国猪群中是否存在及其感染情况,本研究利用套式PCR方法首次检测了来自广东、福建和江西等7个省份的258份血液样品和组织样品.结果表明猪群中TTV1和TTV2感染总阳性卒分别为37.6%和82.6%.两者的混合感染率为38.4%.挑选部分阳性样品用套式PCR引物扩增出TTV1和TTV2的部分非编码区(UTR)片段,并将扩增出的部分UTR基因与已报道的TTV1和TTV2病毒UTR序列进行比较分析,同时我们选择了8份阳性样品进行了TTV1和TTV2的全长基因的扩增和克隆.分析结果显示TTV可分为TTV1和TTV2两大分支,其中我们分离获得的TTV1和TTV2之间的UTR核苷酸同源性分别为80.8%～98.5%和94.2%～100%,而与参考株相比同源性分别为82.7%～100%和95.5%～99.1%.本研究首次证实在我国猪群中存在TTV感染,提示我们对猪群感染的TTV是一个不容忽视的新病原.     

乙型脑炎病毒E蛋白Ⅰ、Ⅱ结构域抗原表位鉴定

为鉴定乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白I,II结构域抗原表位,本研究设计了一系列针对E蛋白的I、II结构域(1aa～296aa)部分重叠短肽,分别进行GST融合表达,用JEV阳性血清进行western blot和ELISA反应性筛选,获得了5个线性抗原表位分别为:E1(1FNCLGMGNRDFIEGAS16)、E10-4(77TGEAHNEK84)、E11-2(83EKRADSS YVCKQ94)、E19(145GTTTSENHGNYSAQVG160)和E33(257SQEGGLHHALAGAIVV272)。除E10和E19外,其它表位均为第一次通过实验方法确定的。将这5个融合蛋白对小鼠进行免疫,获得了高滴度的针对5个融合短肽的抗血清,研究证明了这些表位具有良好的免疫原性。本研究为乙型脑炎特异性诊断试剂及表位疫苗的开发奠定了基础。     

猪圆环病毒2型与猪TTV混合感染的流行病学调查

根据GenBank_h发表的猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）基因组序列和TTV（Torquetenovirus）1、2型的UTR序列设计合成引物，建立了分别用于检测PCV2和TTV1、TTV2的PCR及巢式PCR方法。应用建立的PCR方法对送检的广东、福建和江西等7个省份258份血液和组织样品进行了PCV2、TTV1和TTV2的检测，确定猪群中PCV2与TTV1和／或TTV2混合感染情况。结果表明，94份样品表现为PCV2和TTV1的混合感染，占样品总数的36．4％；193份样品表现为PCV2和TTV2的混合感染，占74．8％；另外，还有一些样品为三重感染，占34．5％。由此可以看出，猪群中PCV2和／或TTV1和／或TTV2的混合感染很普遍。     

我国高致病性猪蓝耳病病毒的演化分析

自2006年以来,我国大面积暴发高致病性猪蓝耳病,但目前对其病原HP-PRRSV的起源还不得而知.本试验通过对多株HP-PRRSV进行全长基因组分析,发现HP-PRRSV中存在4处缺失,而且这4处缺失是逐步形成的,在中间过渡类型的毒株中存在着缺失1处、2处、3处的毒株.此外,中间过渡类型毒株中的一些氨基酸基序也是逐步变化的.本试验初步阐明了我国HP-PRRSV的起源是CH-1a-1ike PRRSV,在中间过渡的毒株中能够发现逐步演变的轨迹.     

表达外源基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆的构建及病毒拯救

为建立表达标记基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,本研究在PRRSV HuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将新城疫病毒(NDV)NP蛋白末端优势抗原区插入PRRSV NSP2蛋白的复制非必须区,经基因片段的克隆、拼接,构建了含有外源标记基因的感染性的PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ52+NP49。用限制性内切酶SwaΙ将psk-HuN4-F112-Δ52+NP49线性化后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法将病毒RNA转染叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)包装出病毒粒子,再转接到猴胚胎肾上皮细胞(MACR-145)传代拯救病毒。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(病毒基因组14667位人工产生的MluⅠ酶切位点)和插入的标记基因序列。间接免疫荧光试验表明,外源基因NP49在拯救的PRRSV中表达,且能够在PRRSV传代过程中稳定遗传。病毒生长特性比较显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了含有标记基因PRRSV的感染性克隆并获得了拯救病毒,为进一步开发新型PRRS疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。