表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组马立克氏病病毒的构建

采用聚合酶链反应或反转录聚合酶链反应扩增出H5亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因、网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)、马立克氏病病毒(MDV)Rispens CVI988毒株基因组的sorf 1和sorf 2序列、两端带loxp位点的lac/smGFP标志基因,构建含这些基因的转移载体质粒pMHA;以MDV Rispens CVI988毒株的基因组DNA和PMHA质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),采用同源重组方法将LTR、lac/smGFP和HA基因插入到MDV基因组,获得重组病毒rMDV-HA/GFP;以cre介导的同源重组去除lac/smGFP标志基因,再转染CEF,获得仅带LTR启动子和HA基因的重组MDV疫苗毒株rMDV-HA.rMDV-HA仍保留了MDV RispensCVI988疫苗毒株的复制特点,并能稳定表达AIV的HA.     

犬副流感病毒单克隆抗体的研制及其特性鉴定

为研制犬副流感特异性诊断试剂,我们以犬副流感病毒(CPIV)免疫8周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术获得4株稳定分泌针对CPIV的单克隆抗体(MAb)细胞株,分别命名为4F386、584C9、4G7F4和4C9D8.4株MAb腹水针对CPIV的间接ELISA抗体效价达1:10~5～1:10~6,与犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)均不发生交叉反应.MAb 4F386和4C9D8为IgG,5B4C9和4G7F4为IgM.Western blot检测表明,4F386与CPIV的F蛋白发生特异性反应,4G7F4与CPW的HN蛋白发生特异性反应,而584C9和4C9D8不与变性的CPIV蛋白发生反应.4株MAb均具有中和病毒活性,间接免疫荧光检测均呈为阳性.本研究为进一步研制CPIV特异性诊断和治疗制剂创造了条件.     

新城疫抗体水平与免疫保护相关性试验

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的禽类的一种急性、高度接触性传染病,给养禽业带来巨大的经济损失.免疫接种是控制ND的重要措施,而科学合理的免疫程序是确保免疫效果的关键.随着疫苗的广泛应用,近年来ND的流行已得到明显控制.但由于我国养殖模式多样,生物安全水平不一,以及免疫程序混乱,免疫鸡群仍经常发生ND[1-4].本试验从免疫保护抗体水平临界值、疫苗的免疫期等方面研究了影响ND免疫程序的因素,为制定合理的免疫程序提供依据.     

新城疫病毒Ulster株血凝素-神经氨酸酶基因的克隆与鉴定

新城疫病毒Ｕｌｓｔｅｒ株经ＳＰＦ鸡胚增殖和超速离心纯化后，以酚－ＳＤＳ法提取其基因组ＲＮＡ，作为反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）的模板。根据其已发表的Ｆ和ＨＮ基因核苷酸序列，合成一个长为３０ｍｅｒ的寡核苷酸（位于Ｆ基因内）和一对分别长为２８、３０ｍｅｒ的寡核苷酸（位于ＨＮ基因两侧）分别作为反转录引物和ＰＣＲ引物。扩增反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，出现一条长为１．９３ｋｂ的特异性条带，与预期相符。并将此特异性条带克隆入质粒载体ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）中，并经限制性核酸内切酶分析（ＲＥＡ）。ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＥＡ结果证实其为新城疫病毒Ｕｌｓｔｅｒ株的血凝素－神经氨酸酶基因。     

新城疫病毒F48E8株血凝素—神经氨酸酶基因的克隆与鉴定

应用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）获取新城疫苗病毒Ｆ４８Ｅ８株的血凝素－神经氨酸酶基因。扩增反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，长约１．９３ｋｂ与预期结果相符，将其克隆入质粒载体ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）中，经限制性内切酶分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实为新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８株的血凝素－神经氨酸酶基因。     

血清Ⅱ型鸡马立克氏病毒Z_4毒株的毒力稳定性试验

Z_4是我国首次分离到的一株血清Ⅱ型马立克氏病毒(MDV)。该毒株不仅对易感鸡无致病作用,而且与血清Ⅲ型火鸡疱疹病毒(HVT)之间存在着很强的协同保护作用。是一比较理想的制备鸡马立克氏病二价疫苗的候选毒株。我们     

检测鸭呼肠孤病毒抗体间接ELISA方法的建立

RT—PCR扩增鸭呼肠孤病毒（Duckreovirus,DRV）的dB基因,克隆到pET-32a（＋）表达载体,再转化大肠杆菌Transetta（DE3）;含有重组质粒pET—σB的大肠杆菌经IPTG诱导,获得大小为55000的以包涵体形式表达的σB重组蛋白。Westernblotting显示,σB重组蛋白能够与兔抗DRV多抗血清特异性结合。以高亲和NI—NTA树脂在变性条件下纯化、梯度尿素复性的σB重组蛋白为包被抗原,建立了检测DRV抗体的间接ELSIA方法。分别以间接ELSIA方法和血清中和试验对DRV感染鸭血清和SPF鸭血清进行检测,两者的符合率为100％。该间接ELSIA方法对鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒和禽流感病毒阳性血清均无交叉反应。     

鸡痘病毒载体复制非必需片段优化及强启动子的筛选

以痘苗病毒启动子Ｐ７．５调控的β－半乳糖苷酶基因为检测基因,分别插入三个复制非必需片段构成重组质粒,脂本介导转染鸡痘病毒中国疫苗株２８２Ｅ４感染原代鸡胚成细胞（ＣＥＦ）单层,蓝斑选纯化病毒;将重组病毒感杂次代ＣＥＦ,收获细胞后制备提取物,检测其中的β－半乳糖苷酶的活性,由此得到一个基因表达效率高的复制非必需片段ｐＦＰＶ７ｓ。根据痘苗病毒天然启动子Ｐ７．５的结构,人工合成４条寡核苷酸,形成一个早期和     

鸡γ-干扰素基因的克隆与鉴定

干扰素是动物机体内复杂的免疫网络中起调节作用的重要细胞因子之一.在体内广泛参与免疫调节及炎症反应等生物过程,具有十分重要的生理功能.目前已有一大批人和动物的干扰素基因被克隆.以重组干扰素作为免疫调节剂及基因治疗剂已显示出广泛的应用前景,成为重要的学科增长点之一.     

新城疫病毒F_（48）E_8株cDNA文库的构建

以ＳＰＦ鸡胚繁殖我国标准新城疫病毒Ｆ＿（４８）Ｅ＿８强毒株，经蔗糖密度梯度超速离心纯化病毒。再以酚－ＳＤＳ法提取病毒基因组ＲＮＡ，作为反应模板、采用Ｐｒｏｍｅｇａ公司商品试剂盒合成双股ｃＤＮＡ。以同聚物加尾的方法将ｃＤＮＡ克隆到质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（一）中，经ＡＩＸ平板筛选，限制性内切酶分析和Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的核酸探针检测，共获得插入外源片段大小在０．６～４．８ｋｂ的阳性克隆７５个，初步构建了Ｆ＿（４８）Ｅ＿８株的ｃＤＮＡ文库