猪巨细胞病毒gB蛋白抗原表位富集区的表达和抗原性的分析

为表达猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因,本研究根据GenBank登录的PCMV gB基因序列设计1对引物,以感染PCMV猪肺细胞总DNA为模板,采用PCR扩增得到gB基因片段,克隆于pMD-18T并进行核苷酸序列测定。利用DNAStar分析gB蛋白的抗原表位,选择抗原表位富集的2个基因片段(命名为PCMVgB1和PCMVgB2)分别克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒并转化Rosetta(DE3)宿主菌。结果显示:扩增的gB基因与GenBank登录的PCMV gB基因的核苷酸同源性在97.6%～98.9%之间,推导的氨基酸同源性在97%～98.6%之间。经IPTG诱导的含pET-gB1和pET-gB2重组质粒的宿主菌可表达重组gB1和gB2蛋白,SDS-PAGE显示分子量约为62ku和36ku。Western blot和间接ELISA结果表明,重组gB1和gB2蛋白均具有反应原性。     

一例猪繁殖与呼吸综合症病毒变异株感染的实验室诊断报告

本实验通过免疫学和分子生物学的方法,对湖南省浏阳市某疫区猪场是否存在猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)变异株感染进行了确诊,并对该病的诊断和防控做出了讨论。     

BHK-21单细胞克隆敏感株筛选及日本脑炎病毒分离

为筛选出日本脑炎病毒(JEV)敏感度高的BHK-21细胞株,采用终点稀释法从母代BHK-21混合细胞中分离单细胞克隆株,应用接种BHK-21克隆株方法,从JEV阳性蚊子样品研磨液中分离病毒,筛选出的3号单细胞克隆株经3次传代后细胞产生明显病变,分离到1株JEV,5号单克隆株培养物核酸检测呈阳性,但是不产生细胞病变,母代混合细胞没有病变,JEV核酸检测阴性。根据1、3型JEV的prM与E基因设计4对引物初步鉴定分离株基因型,鉴定分离株为1型JEV。综合以上结果,构建的BHK-21单细胞克隆株比BHK-21混合细胞对分离JEV株敏感,更适合JEV的分离与培养。     

3种亚群PCV-2感染性克隆的构建及体内外感染性

通过PCR扩增出猪圆环病毒2(PCV-2)3个亚群(1A、1B、1C)毒株的全基因组DNA序列,并分别克隆入pMD-18T载体,获得含有PCV-2全基因组的3个重组质粒,分别命名为RP8(1A)、P0(1B)和P4-1(1C).将3个重组质粒分别用SacⅡ切出1767 bp的PCV-2全基因组,并在体外分别用T4连接酶连接而环化.用脂质体将3种自身环化的基因组转染无PCV-1污染的PK-15细胞,并按常规病毒培养方法分别传代,第5代细胞培养物分别用间接免疫荧光试验(IFA)及PCR方法检测转染的细胞,检测结果均为阳性,说明已获得PCV-2共3个亚群1A、1B、1C的感染性克隆.用1A、1B、1C感染性克隆的第5代细胞培养物分别接种小鼠,可在接种小鼠的血液中分别检测到相应PCV-2亚型的基因组DNA,表明本试验构建的自身环化的1A、1B、1C亚型的PCV-2的全基因组DNA在体内、体外均具有感染性.     

O型口蹄疫病毒代表性抗原VP1基因的人工合成与表达及其免疫原性检测

通过对GenBank近10年内收录的O型口蹄疫(FMD)病毒 VP1基因序列的同源性比较分析,并根据中国、老挝、缅甸等国家FMDV流行毒株的基因序列,设计并合成了有群内抗原代表性的结构蛋白VP1全基因序列.将合成的序列克隆到原核表达载体pET-28a( )中,构建了VP1的表达质粒pETVP1.SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该质粒的BL21(DE3)LysS转化菌在IPTG诱导下可特异性表达VP1蛋白,该重组蛋白以包涵体的形式存在,相对分子质量约30 000,能与口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清发生特异性反应.动物接种试验表明,重组蛋白能诱导小白鼠产生特异性抗FMDV抗体.     

天门市农区小家鼠消长规律及防控策略

根据1998～2010年12a鼠情监测,明确了小家鼠在天门农区的消长繁殖规律.12a间出现了3次波动,1999年至2001年处于优势地位,2002年至2005年略低于黄胸鼠.从2006年至今又上升为优势位置.全年以6、9、12月为上夹率高的三个峰期,1、7月上夹率最低.雌雄性比例为1:0.72.胎平仔数4.64只,子宫...     

母猪猪瘟持续性感染引起仔猪死亡的诊断

湖南株州某猪场发生一起后备母猪第一胎新生仔猪出生后半个月左右发病，发病后约5～6天死亡，通过临床症状和病理剖检初步诊断为猪瘟，最后通过RT—PCR确诊为母猪持续性感染猪瘟病毒所致的仔猪先天感染。通过应用超前免疫方案，控制了仔猪的死亡。     

湖南地区I型乙型脑炎病毒的分离鉴定及E基因序列分析

为探寻湖南汨罗地区猪场蚊子携带乙型脑炎病毒(JEV)的情况，对该地区3个猪场蚊子开展JEV的病原学调查研究。从该地区3个种猪场采集约3 900只蚊子，用RT–PCR方法扩增JEV NS5基因，结果从40份样品中检出17份样品呈阳性。将阳性样品研磨液接种BHK–21细胞分离病毒，经3次传代后获得了1株JEV，将新分离株命名为HNML1株。根据JEV的E基因序列设计1对引物，用RT–PCR方法扩增HNML1株的E基因，并进行序列测定和同源性分析，结果表明，该E基因的核苷酸序列与减毒活疫苗株SA14–14–2相应序列的同源性为86.9%；该E基因的氨基酸序列与减毒活疫苗株SA14–14–2 相应序列的同源性为97.0%，二者存在15个氨基酸的差异(其中包括8个与关键毒力相关的氨基酸)。基因同源性分析结果表明，HNML1株为基因I型JEV毒株。     

猪巨细胞病毒的PCR检测及其gB基因特征分析

根据GenBank登录的猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因序列设计检测引物和全长gB基因引物,对来自湖南浏阳和江西景德镇不同养殖场的猪鼻拭子样品(51份)进行PCR检测,60.78%(31/51)的鼻拭子样品扩增出了260 bp的特异性条带.再以阳性样品为模板扩增全长gB基因,并将其克隆到pMD18-T载体,核苷酸序列测定和结果分析表明,所获得PCMVgB基因序列全长2 580 bp,编码860个氨基酸,与国外PCMV分离株的核苷酸同源性为97.6% ～ 98.9%,氨基酸同源性为97.0%～98.6%,且 PCMV可分为2个群:一群为中国湖南株、英国株和德国株,命名为A群;另一群为日本株、瑞士株和西班牙株,命名为B群.抗原表位优势、亲水性、表面可及性预测分析表明,PCMVgB蛋白是理想的免疫学抗原候选蛋白.