葡萄牙使用非洲猪瘟弱毒疫苗的历史案例分析

1957年4月非洲猪瘟(African swine fever,ASF)首次从非洲大陆传至葡萄牙里斯本,1960年4月再次传入葡萄牙并快速蔓延。因担心疫情失控及对养猪业发达地区产生影响,葡萄牙自1962年5月启动ASF疫苗田间试验。部分数据显示:接种疫苗21 d后,ASF的群体发病率为0.96%,个体发病率为1.05%;接种1个月后约有12.1%的猪出现了并发症,表现为呼吸系统、消化系统、肌肉骨骼和皮肤等方面的问题;母猪接种后部分出现流产或不孕;疫苗接种猪的肺部病变占比(21.92%)比未接种猪(4.82%)高,且不同品种猪的肺炎发病率差异较大。由于疫苗临床使用时不确定性因素较多,最终导致免疫计划终止。分析失败原因,可能是葡萄牙整体猪群健康状况较差、病毒污染面较大以及当地品种猪的易感性较高等。为科学看待ASF疫苗的使用经验和教训,本文对20世纪60年代葡萄牙的ASF"免疫失败事件"进行阐述和分析,以期为未来ASF疫苗研制提供借鉴。     

PCR假阳性的原因分析及控制措施

近二十年来,PCR作为一种重要的分子生物学技术,广泛应用于动物疫病的病原学、诊断方法、基因工程疫苗研究、检验检疫、疫病诊断、疫情监测及流行病学调查等动物疫病防控实际工作。如何控制好PCR检测的质量,减少假阳性,一直是研究者普遍关注的问题。本文分析了PCR假阳性形成的原因,提出预防及控制措施,为促进实验室PCR实践工作提供参考。     

鸡痘病毒抗体在鹌鹑体内的消长规律

采用鸡痘弱毒疫苗按1个使用剂量、增加免疫剂量、2次免疫和对照组(生理盐水)对鹌鹑进行刺种,在免疫后的1～8周采血,检测特异性抗体和中和抗体,研究鸡痘病毒抗体在鹌鹑体内的消长规律,对鸡痘病毒疫苗应用于鹌鹑的免疫效果及生物安伞性进行初步评价.在试验期间试验动物精神状态良好,采食、饮水正常,未发生病理变化:抗鸡痘病毒特异性抗体和中和抗体效价免疫后1周显著升高,3周达到高峰,5周开始下降,8周时仍高于对照组的抗体水平,增加免疫剂量组产生的抗体水平高,但消长规律与使用剂量组相同.表明鸡痘病毒疫苗能刺激鹌鹑产生特异性抗体和中和抗体,维持时间较长,无毒副作用,生物安全性好.     

部分商品化非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的比对

为获得商品化非洲猪瘟病毒(ASFV)荧光PCR检测试剂盒的敏感性、特异性、一致性和最低检测限等试验数据,以世界动物卫生组织(OIE)推荐引物探针为金标准,以62份已灭活的ASFV阳性田间样品、32份阴性田间样品和P72基因核酸标准物质为检测对象,对农业农村部公布许可的其中17个厂家生产的商品化ASFV荧光PCR检测试剂盒开展了试验特性方面的比对研究。结果显示,17个厂家生产试剂盒的敏感性最低为77.4%,最高为96.8%,特异性最低为87.5%,最高为96.8%,均未达到100%,且有一定差别;12个厂家的试剂盒与OIE推荐引物探针检测结果一致性较好(Kappa值≥0.75),其余5个厂家的试剂盒与其一致性一般(0.4Kappa值0.75);17个厂家的试剂盒均可检测到的最低稀释度为5.9×10~3×2~(-3)拷贝/μL,但不同厂家试剂盒的最低检测限有所差别,其中5个试剂盒可检测到的最低稀释度为5.9×10~3×2~(-3)拷贝/μL,2个试剂盒为5.9×10~3×2~(-4)拷贝/μL,6个试剂盒为5.9×10~3×2~(-5)拷贝/μL,3个试剂盒为5.9×10~3×2~(-6)拷贝/μL,1个试剂盒至少为5.9×10~3×2~(-7),且大部分国产试剂盒的最低检测限比进口试剂盒低。本研究为ASFV荧光PCR检测试剂盒的筛选和比对提供了参考数据。     

兔出血症病毒VP60蛋白T细胞表位优势区的筛选

应用戊二醛醛化的人的“O”型红细胞纯化兔出血症病毒(RHDV),对非免兔进行3次免疫后,经分段表达的重组杆状病毒、纯化的病毒、Con A分别刺激后进行细胞增殖检测、IL-2、IL-4、IFN-γ检测.WST检测结果表明,3号重组杆状病毒刺激的值最高,所有重组杆状病毒与空白对照组差异显著；IL-2和IFN-γ检测结果表明,3号重组杆状病毒刺激的值最高,其次为2号、4号,而1号、5号重组杆状病毒刺激指数较低,但均高于对照组；IL-4检测结果表明,2号、3号、4号重组杆状病毒刺激的值低于对照组,1号、5号重组杆状病毒刺激组略低于对照组.研究结果表明,重组病毒3号区域为RHDV VP60 T细胞表位的优势区,从而为后期的试验奠定了基础.     

羊痘病毒属病毒通用Cycleave PCR检测方法的建立

为快速特异检测羊痘病毒属病毒（CaPVs）,比较了牛结节性皮肤病病毒（LSDV）、山羊痘病毒（GTPV）和绵羊痘病毒（SSPV）的全基因组序列,选择保守区域设计特异性引物和探针,建立了一种CaPVs通用的Cycleave PCR检测方法。特异性结果显示,该方法在40 min内即可检出CaPVs,与口蹄疫病毒、羊口疮病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒均无交叉反应;灵敏性结果显示,最低检出限为4.98 copies/μL;重复性结果显示,批内和批间重复变异系数均小于2%。对131份临床样本进行检测发现,该方法与世界动物卫生组织（WOAH）推荐的常规PCR方法相比,敏感性为100%,特异性为91.55%,总符合率为95.42%。以上结果表明,本研究建立的Cycleave PCR检测方法特异、敏感、重复性好,且操作简便,适用于CaPVs的高通量、快速检测。     

布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据布鲁菌BCSP31基因序列设计布鲁菌通用检测引物和探针,建立了布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法。以构建的含BCSP31基因的质粒标准品10倍递进稀释为模板检测其敏感性,结果显示,本方法能检测约10个拷贝的阳性质粒,且标准曲线的线性关系良好。用本方法检测5株不同种的布鲁菌以及猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等4株对照菌。结果显示,5株不同种的布鲁菌均出现典型的"S"型扩增曲线,4株对照菌40个循环内均无CT值出现。用本方法和B4/B5-PCR方法对来自布鲁菌病流行地区3个不同牛场的40份血样、奶样和血清样进行平行检测。结果显示,本方法和B4/B5-PCR方法的结果符合率为80.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的27份样品经本方法检测均为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的13份样本,经本方法检测,其中8份呈阳性,5份为阴性。本方法的敏感性明显高于B4/B5-PCR方法。试验表明,所建立的Cycling探针荧光定量PCR方法具有敏感、特异、稳定等特点,可用于布鲁菌感染的快速检测。     

重组酶聚合酶扩增技术及其在动物病毒病检测中的应用

重组酶聚合酶扩增技术是近年来建立起的一种常温DNA扩增技术,具有灵敏度高、特异性强、反应速度快、所需仪器简单等优点。本文介绍了该技术的检测原理、引物及探针设计和影响因素,分析了该技术在动物病毒病检测方面的应用,指出该技术具有良好的现场快速检测与多重及大量样品检测的应用前景。     

RHDV VP60“通用型”T细胞表位预测

兔病毒性出血症核衣壳蛋白VP60是兔出血症病毒的主要结构蛋白,具有很强的抗原性和免疫原性,可诱导细胞免疫,在抗病毒免疫中起着关键作用.确定T细胞所识别抗原分子上的短肽序列对T细胞表位进行定位,对于研究特异性免疫应答有着重要意义.本研究应用T细胞抗原表位分析的研究方法,预测VP60T细胞蛋白质抗原表位,为后期试验奠定了基础.     

布鲁氏菌弱毒疫苗鉴别技术研究进展

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种重要的人畜共患传染病,不仅给畜牧业造成严重的经济损失,并威胁人类健康。弱毒疫苗免疫是防控布病的重要手段,但弱毒疫苗的使用往往对布病的诊断和监测造成干扰。各国学者利用细菌学、免疫学、分子生物学等技术手段,建立了病原分离鉴定、补体结合试验、利凡诺尔试验、酶联免疫吸附试验、荧光偏振实验、限制性片段长度多态性、PCR、real-time PCR等多种布鲁氏菌弱毒疫苗鉴别检测方法。研究表明,ELISA和FPT以其高通量以及操作方便的优势,在布鲁氏菌弱毒疫苗与野生菌株感染的血清学鉴别诊断方面前景良好;分子生物学特别是PCR、real-time PCR方法目前仍广泛用于布鲁氏菌纯培养物的鉴定。