F107(F18ab)菌毛单抗的制备、鉴定与初步应用

将大肠杆菌107／86和水肿病菌株在TSB中培养，鉴定其表达F107菌毛，前者作为免疫原免疫BABL／C小鼠，后者作为检测抗原包装酶标板。细胞融合后经ELISA和玻板凝集检测，得到一株阳性杂交瘤细胞株，命名为F7－1。该细胞株制备的腹水ELISA效价为：2^16，试管凝集价为：1：5120，在免疫印迹中可与提取的F107菌毛特异性条带发生反应。利用此单抗检测表明，91％的水肿病菌株表达F107菌毛。     

类志贺毒素Ⅱ型变异体B亚单位单抗的制备和初步应用

将表达类志贺毒素II型变异体B亚单位融合蛋白的菌株ppSLT-IIeB在含氨苄青霉素的2×YTA培养基中培养,至对数生长期时加入IPTG诱导,诱导的重组菌超声波裂解后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达融合蛋白。用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白,测定纯化蛋白的浓度,免疫BALB/C小鼠,细胞融合后经ELISA检测,得到一株阳性杂交瘤细胞,命名为7C3-1,制备的单抗腹水ELISA效价为210,Westernblet结果表明此单抗仅与融合蛋白反应,而与载体蛋白不反应。利用此单抗检测18株水肿病菌株,发现有13株产类志贺毒素II型变异体。     

仔猪水肿病的诊断与防治

猪水肿病是仔猪的一种急性致死性疾病。主要由产 Vero细胞毒素 (Verotoxin,VT)大肠杆菌(VTEC)引起。在发病猪群中 ,发病率低 ,但死亡率高 ,可达 90 % ,给养猪业造成了相当大的经济损失。VTEC有两个毒力因子即 F1 0 7(F1 8ac)菌毛和水肿病毒素 ;F1 0 7菌毛是近 1 0年来才发现的 ,其抗原性区别于 K88、K99、987P、F41等菌毛 ,具有 3 7℃表达、1 8℃不表达、非血凝性等特点 ;水肿病毒素即志贺样毒素 型变异体 ,分 A、B两个亚单位 ,A亚单位具有完全的毒性作用。致病基本原理是细菌依靠F1 0 7菌毛吸附于小肠上皮细胞 ,水肿病毒素 B亚…     

类志贺毒素II型变异体B亚单位单抗的制备和初步应用

将表达类志贺毒素II型变异体B亚单位融合蛋白的菌株ppSLT-IIeB在含氨苄青霉素的2×YTA培养基中培养,至对数生长期时加入IPTG诱导,诱导的重组菌超声波裂解后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达融合蛋白。用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白,测定纯化蛋白的浓度,免疫BALB/C小鼠,细胞融合后经ELISA检测,得到一株阳性杂交瘤细胞,命名为7C3-1,制备的单抗腹水ELISA效价为210,Westernblet结果表明此单抗仅与融合蛋白反应,而与载体蛋白不反应。利用此单抗检测18株水肿病菌株,发现有13株产类志贺毒素II型变异体。     

志贺样毒素II型变异体A亚单位单抗的制备

将表达志贺样毒素II型变异体A亚单位重组蛋白的菌株ppSLT -IIeA在含氨苄青霉素的 2×YTA培养基中培养 ,至对数生长期时加入IPTG诱导 ,诱导的重组菌超声波裂解后 ,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达重组蛋白。用谷胱苷肽活化的Sepharose 4B亲和层析柱纯化重组蛋白 ,测定纯化蛋白的浓度 ,免疫BALB/c小鼠 ,细胞融合后经ELISA检测 ,得到一株阳性杂交瘤细胞 ,命名为A2 _D3 ,制备的单抗腹水ELISA效价为 2 4log2 ,免疫印迹结果表明此单抗仅与重组蛋白反应 ,而与载体蛋白不反应。利用此单抗检测 13株水肿病菌株 ,发现均产志贺样毒素II型变异体     

F107(F18ab)菌毛的提取、提纯及鉴定

将致仔猪水肿病菌株107/86在TSB、TSA培养基上传代,使之表达F107菌毛,大量收集菌毛化的细菌,利用热洗脱法提取菌毛.粗提菌毛经1 5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳可见一条约15ku的条带,以染色的凝胶为对照,将未染色凝胶上的菌毛条带切下,捣碎,加生理盐水,37℃,2h后离心,吸出上清再次电泳,可见提纯的菌毛条带.用针对F107菌毛的单抗做免疫印迹反应,证实此条带为F107菌毛蛋白.     

致仔猪水肿病大肠杆菌快速检测方法的建立

将水肿病菌株S在TSB培养基中连续传代两次 ,离心后用生理盐水洗涤 ,制成1×108的细菌悬液。菌液倍比稀释 ,分别与适当浓度的F107菌毛单抗作玻板凝集、间接ELISA、斑点 -ELISA试验 ,结果表明 ,当单抗100×稀释时 ,三种方法的细菌最小检出量分别为2.5×107、6×105、1×103,斑点 -ELISA最敏感。从患水肿病的仔猪小肠黏膜上刮取黏液 ,溶于PBS中 ,将此溶液一部分稀释后在麦康凯平板上菌落计数 ,另一部分作为抗原做斑点 -ELISA。结果显示致病菌在小肠黏膜上大量存在 ,斑点 -ELISA能敏感、快速的检测出来。这一检测方法的建立 ,为其它大肠杆菌病的诊断提供了较好的借鉴。     

SLT-IIeA基因在原核系统中的克隆与表达及其鉴定

PCR扩增并克隆在pUC18质粒中的类志贺样毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）A亚单位基因片段切出，按预定阅读框架插入到原核性表达载体pGEX-6p-1的谷胱甘肽S－转移酶（GST）基因的下游，获得重组质粒ppGEX-A。重组粒导入大肠杆菌BL21，用IPTG进行诱导表达，通过对重组大肠杆菌的菌体裂解物的SDS－PAGE电泳分析及Western-blot鉴定，表明重组菌能大量表达融合蛋白形成的SLT-ⅡeA，即SLT-ⅡeA蛋白与谷胱甘肽转移酶相连组成的蛋白质。本实验的研究结果，为进一步研究SLT-Ⅱe的生物学特性及研制仔猪水肿病业单位苗提供了有效的生物材料。     

志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位单抗的制备

将表达志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位重组蛋白的菌株ppSLT-ⅡeA在含氨苄青霉素的2×YTA培养基中培养,至对数生长期时加入IPTG诱导,诱导的重组菌超声波裂解后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达重组蛋白.用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化重组蛋白,测定纯化蛋白的浓度,免疫BALB/c小鼠,细胞融合后经ELISA检测,得到一株阳性杂交瘤细胞,命名为A2-D3,制备的单抗腹水ELISA效价为24log2,免疫印迹结果表明此单抗仅与重组蛋白反应,而与载体蛋白不反应.利用此单抗检测13株水肿病菌株,发现均产志贺样毒素Ⅱ型变异体.     

致仔猪水肿病大肠埃希氏菌F107菌毛抗原的提取及鉴定

将致仔猪水肿病大肠埃希氏菌107／86菌株在TSB、TSA培养基上传代，使之表达F107菌毛，大量收集菌毛化的细菌，利用热洗脱法提取菌毛抗原。粗提菌毛抗原经聚丙烯酰胺凝胶电泳可见一条约15ku的条带，以染色凝胶为对照，将未染色凝胶上的菌毛抗原条带切下，进行提纯。经免疫印迹反应，证实其条带为F107菌毛蛋白。