农田水样中微囊藻毒素-LR拉曼检测方法的研究

本研究建立了基于表面增强拉曼散射技术(Surface-enhanced Raman scattering,SERS)的农田水样中微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MC-LR)的检测方法。采用柠檬酸钠还原法制备金种(Au nanoparticles,Au NPs),通过媒介增长法制备了刺状金纳米颗粒(Spiny gold nanoparticles,SGNPs),使用紫外-可见吸收光谱(Ultraviolet visible,UV-vis)、透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)和探针分子(对巯基苯甲酸,4-mercaptobenzoic acid,4-MBA)对SGNPs进行了表征及鉴定。研究以三角状金纳米颗粒作为基底,选择MC-LR在1 007 cm~(-1)和1 309 cm~(-1)处的特征峰作为定量峰,激光器激发波长为785 nm,积分时间20 s,建立检测方法。本研究建立的检测方法在1.0～100 000μg·L~(-1)的浓度范围内具有良好的线性关系,检测限(LOD)和回收率分别为1.0μg·L~(-1)和80%～102%,使用本方法对镇江市内运粮河及古运河的灌溉水样进行检测,MC-LR的检出率为40%,含量最高达1.81μg·L~(-1),检测结果与LC-MS/MS比对,相关系数为0.84。本研究建立的方法快速准确,前处理简单,能满足农田水样中MC-LR的现场快速检测的要求。     

微囊藻毒素MC-LR对罗非鱼（Oreochromis niloticus）肝脏谷胱甘肽含量及其相关酶活性的影响

采用腹腔注射的方式研究了微囊藻毒素MC-LR（注射剂量为500μg.kg-1 BW）胁迫下罗非鱼（Oreochromis niloticus）肝脏谷胱甘肽（GSH）含量及其相关酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）、谷胱甘肽还原酶（GR）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性的动态变化。结果表明,MC-LR能够对罗非鱼肝脏GSH含量及其相关酶活性产生明显影响。在MC-LR胁迫下,与对照组相比,GSH含量呈现先下降后上升趋势,总体上被诱导;罗非鱼肝脏γ-GCS和GST在试验过程中出现两次显著升高现象,在GST作用下,GSH与MC-LR结合会造成GSH的消耗,γ-GCS和GR的活性增强能够使GSH含量升高,从而使罗非鱼肝脏GSH能够维持一定水平;GR和GPx的活性均表现为先上升后下降,它们能有效调节罗非鱼肝脏GSH-GSSG缓冲系统,从而在减轻或消除由MC-LR侵入而造成的肝细胞氧化胁迫中发挥重要作用。     

微囊藻毒素-LR诱发的甲状腺毒性对斑马鱼胚胎发育的影响

研究了微囊藻毒素-LR(MC-LR)对斑马鱼的毒性,将受精后的斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的MCLR(0、0.6、1.2和2.4 mg/L)。结果表明,144 h后斑马鱼生长受到抑制、体长显著降低,同时其下丘脑-垂体-甲状腺轴(HPT)相关基因的表达模式也发生了显著变化。MC-LR可能通过调节HPT轴重要基因的表达来干扰甲状腺激素的分泌,继而干扰鱼类胚胎的生长发育。     

草鱼Rab1A基因的克隆表达、抗体制备及对微囊藻毒素-LR的响应

为了解草鱼(Ctenopharygodon idella)小分子三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白家族成员Rab1A的分子结构特点及其在微囊藻毒素-LR (MC-LR)胁迫中的作用,本研究根据草鱼肝脏(MC-LR诱导)转录组测序获得的unigenes序列,采用RACE技术克隆了草鱼Rab1A基因cDNA,其全长序列为806 bp,开放阅读框为609 bp,编码202个氨基酸。同源性分析结果表明,Rab1A与鲤鱼(Cyprinus carpio) Rab1A3相似性最高。系统进化分析表明草鱼Rab1A与鲤鱼、斑马鱼(Danio rerio)等鱼类聚为一大支。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析发现Rab1A在草鱼各组织中广泛分布,在血液和鳃等组织中的表达较丰富。构建了pGEX-4T-1-Rab1A重组表达载体,并制备了Rab1A多克隆抗体,通过酶联免疫(ELISA)检测抗体效价为1∶512 000以上,Western blot检测显示抗体具有特异性。草鱼肝脏经微囊藻毒素-LR(MC-LR)染毒,发现25和75 μg·g^-1感染96 h后对Rab1A基因和蛋白表达的影响不明显(P>0.05),但100 μg ·kg^-1 可导致草鱼肝脏Rab1A基因和蛋白表达显著下降 (P<0.05),表明Rab1A在参与草鱼抵御MC-LR胁迫过程中起着重要的作用。本研究为进一步了解Rab1A基因的功能及其在MC-LR胁迫过程中所发挥的作用奠定了基础。     

An acute case of intoxication with cyanobacteria and cyanotoxins in recreational water in Salto Grande Dam, Argentina

Cyanobacterial blooms and hepatotoxic microcystins (MCs) usually occur in summer, constituting a sanitary and environmental problem in Salto Grande Dam, Argentina. Water sports and recreational activities take place in summer in this lake. We reported an acute case of cyanobacterial poisoning in Salto Grande dam, Argentina, which occurred in January 2007. Accidentally, a young man was immersed in an intense bloom of Microcystis spp. A level of 48.6 μg·L(-1) of microcystin-LR was detected in water samples. Four hours after exposure, the patient showed nausea, abdominal pain and fever. Three days later, dyspnea and respiratory distress were reported. The patient was hospitalized in intensive care and diagnosed with an atypical pneumonia. Finally, a week after the exposure, the patient developed a hepatotoxicosis with a significant increase of hepatic damage biomarkers (ALT, AST and γGT). Complete recovery took place within 20 days. This is the first study to show an acute intoxication with microcystin-producing cyanobacteria blooms in recreational water.     

基于磁珠和时间分辨荧光免疫分析的微囊藻毒素LR单链抗体筛选与鉴定

【目的】从鼠源合成噬菌体抗体库中,快速分离获得微囊藻毒素LR单链抗体。【方法】采用磁珠筛选和负筛选方法,设计两轮微囊藻毒素LR单链抗体的筛选方案。用噬菌体产出投入比和多克隆噬菌体免疫分析,对每轮筛选后微囊藻毒素LR特异性噬菌体的富集效果进行鉴定。再将第2轮筛选获得的次级库提取单链抗体基因,转入可溶性表达载体;诱导表达后,采用时间分辨荧光免疫法,对单个噬菌体克隆鉴定并测序。【结果】两轮筛选的噬菌体产出投入比分别为4.8×10-8和2.88×10-6。第2轮筛选后的次级库,经多克隆噬菌体免疫分析得到的荧光信噪比,比原始抗体库提高了22.8倍。最终鉴定得到5株不同的阳性噬菌体克隆,其中最佳的克隆对微囊藻毒素LR的检测灵敏度（IC10）为13 ng•mL-1,抑制中浓度（IC50）为435 ng•mL-1,线性范围在31—5 952 ng•mL-1。【结论】本研究筛选到的单链抗体,有潜力应用于微囊藻毒素LR的免疫学检测或免疫亲和柱的制备,同时也探索了一种高效的微囊藻毒素LR单链抗体的库筛选、鉴定方法。     

微囊藻毒素-LR对猪体外成熟卵母细胞氧化损伤与凋亡的影响

旨在探讨微囊藻毒素-LR（microcystin-LR，MC-LR）对体外成熟猪卵母细胞的毒性损伤及其潜在损伤机制。本研究从屠宰场所获得的猪卵巢中收集GV期卵母细胞，将其随机分为4组，在卵母细胞体外成熟培养液中分别添加0、20、40和60 μg·mL^-1 MC-LR，研究MC-LR对卵母细胞第一极体（PbI）排出、纺锤体结构以及细胞内活性氧（ROS）、早期凋亡蛋白（Annexin V）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力的影响，并采用RT-qPCR分析氧化应激和凋亡相关基因SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px、Bax和Bcl2 mRNA的表达变化情况，试验重复3次。结果发现，MC-LR处理导致猪卵母细胞PbI排出率呈浓度依赖性下降，当MC-LR添加浓度达40 μg·mL^-1以上时，卵母细胞成熟率极显著下降（P<0.01），且纺锤体结构异常率极显著升高（P<0.001）；进一步研究发现，MC-LR处理后卵母细胞ROS水平极显著升高（P<0.01），而GSH-Px活性极显著降低（P<0.01），并伴随着抗氧化相关基因SOD1、CAT及GSH-Px mRNA表达极显著下调（P<0.01）；细胞凋亡检测表明，MC-LR处理可导致卵母细胞早期凋亡率极显著增加（P<0.01），凋亡相关基因Bax/Bcl2比值极显著升高（P<0.001）。研究结果表明，MC-LR可诱导猪卵母细胞纺锤体结构异常，并引发氧化损伤与细胞凋亡，最终导致卵母细胞成熟能力下降。     

钇(Y3+)对缺氮、缺磷胁迫下铜绿微囊藻生长和生理特性及藻毒素释放的影响

为探究稀土元素钇(Y~(3+))对缺氮、缺磷胁迫下铜绿微囊藻生长的影响,测定了缺素胁迫下不同Y~(3+)浓度时藻的生长量、叶绿素a、可溶性糖、可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性(超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、过氧化物酶POD)以及丙二醛(MDA)和藻毒素(MC-LR)含量。结果表明:在缺氮、缺磷胁迫下,Y~(3+)对铜绿微囊藻的生长表现出低促高抑的"Hormesis"现象。低浓度Y~(3+)(0.10~0.20 mg·L~(-1))能维持铜绿微囊藻的生长,增强抗氧化酶活性,减轻缺素胁迫造成的损伤;高浓度Y~(3+)(0.50~2.00 mg·L~(-1))则加剧缺氮、缺磷胁迫对藻的迫害,光合色素、可溶性糖及可溶性蛋白含量呈明显的下降趋势,抗氧化酶活性受到抑制,膜质过氧化程度加重,MC-LR含量增加。     

硫掺杂二氧化钛的光催化活性及其对微囊藻毒素的降解

为了更方便高效和绿色环保处理水中的微囊藻毒素(MC-LR),采用溶胶-凝胶法制备了硫(S)掺杂的二氧化钛(TiO2)纳米光催化剂粉体(S-TiO2),利用X射线光电子能谱(XPS)、X射线衍射(XRD)以及紫外可见光的反射光谱,分析测定了催化剂的结构特征,并以浓度为0.1μg/mL的MC-LR的光降解效果考察了其光催化活性,研究其光降解条件。结果表明,本实验制备的催化剂为锐钛矿结构,S以S+6的形式进入TiO2晶格。催化剂的最优制作工艺为:掺杂量([S]/[Ti])0.25,500℃下煅烧3h,且制备的S-TiO2具有较好的稳定性和回收性,重复利用5次,降解率仅下降3.98%;最优MC-LR可见光降解工艺为:光强3 000lx,催化剂投加量0.1g/L,反应时间16h。在此催化剂制备条件以及可见光降解反应条件下,MC-LR的降解率为100%,残留量低于WHO规定的藻毒素含量限值。     

环境相关浓度MC-LR作用对营养生长期水稻生长和抗氧化酶活性的影响

以水稻为受试生物,考察暴露浓度为0、0.1、1、10、50μg·L-1的MC-LR分别水培暴露7、15、20、34 d对水稻生长和根部部分酶活性的影响,考察指标包括水稻的株高、根长、鲜重、光合作用系统以及根系中过氧化物酶、谷胱甘肽酶、蛋白磷酸酶和丙二醛活性。34 d实验结束后,相比对照组,0.1、1μg·L-1MC-LR作用下水稻根长分别增加了6.94%和6.06%,而50μg·L-1MC-LR作用下水稻根长显著减少了8.71%。MC-LR暴露能显著诱导水稻抗氧化系统部分关键指标(如POD和GSH),并且随着暴露时间的延长,诱导作用更加明显。0.1μg·L-1MC-LR暴露20、34 d后,相对于对照组POD分别抑制了58.51%和8.09%。50μg·L-1MC-LR暴露34 d后,POD、GSH和PP分别降低了38.52%、45.86%和52.51%。上述结果表明长期暴露在环境相关浓度下的MC-LR可能会对陆生植物产生毒性效应。