利用酵母双杂交技术筛选与wsv112互作的宿主蛋白

对虾白斑综合征病毒(WSSV)开放阅读框wsv112编码脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTP pyrophosphatase, dUTPase)。为研究wsv112与宿主的互作关系，本研究采用酵母双杂交Gal4系统从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道cDNA文库中筛选与wsv112互作的候选蛋白。以WSSV为模板，构建pGBKT7-112诱饵载体，转化到Y2H Gold酵母菌感受态细胞中，转化菌液涂布到不同缺陷型培养基上，检测诱饵载体的自激性和毒性。将凡纳滨对虾肠道cDNA文库与诱饵菌株pGBKT7-112接合，通过筛选力度不同的缺陷型培养基、颜色反应、PCR、测序鉴定等步骤筛选阳性克隆，将阳性菌株提取质粒，再经过回复杂交实验验证筛选出的阳性质粒与诱饵载体的作用。研究表明，诱饵载体pGBKT7-112无自激性和毒性，可用于酵母双杂交实验；经初筛和回复杂交实验最终得到2个阳性质粒，经过NCBI数据库对比，其编码的蛋白分别与日本囊对虾(Penaeus japonicus) C型凝集素(AGW27416.1)和克氏原螯虾(Procambarus clarkii) 40S核糖体蛋白S20小亚基蛋白(ALE99171.1)具有37%和98%同源性。本研究为wsv112的调控机制提供新的线索。     

猪带绦虫dUTPase基因真核载体的构建及其在BHK细胞中的表达

采用PCR技术从重组克隆载体pGEM-dUTPase中扩增出猪带绦虫六钩蚴dUTPase基因,与表达载体pGFP-C1相连接,构建重组表达质粒pGFP-C1-dUTPase,转化大肠埃希菌DH5α,经测序证实,基因序列完全正确.用脂质体法转染BHK细胞,采用荧光显微镜实时观察和RT-PCR技术确定目的蛋白的表达情况.结果表明,在转染重组质粒48 h后能观察到绿色荧光,表明在BHK细胞中成功地表达了猪带绦虫dUTPase与pGFP-C1的融合蛋白,为下一步重组dUTPase酶活性的研究奠定了基础.     

猪囊尾蚴dUTPase的同源建模及分析

通过SWISS-MODEL服务器对猪囊尾蚴dUTPase（Cysticercus cellulosae dUTPase，CYdUT-Pase）进行同源建模，用SPDBV和DSViewer对模型进行修饰，模型经WHATIF服务器进行质量评估。对已知dUTPase的晶体结构分析后，推测CYdUTPase属于同源三聚体，通过SymmDock服务器进行CYdUTPase三聚物的分子对接，并与人dUTPase3D结构叠合。结果表明，建立的CYdUTPase3D模型是成功的，具有良好的真实性，CYdUTPase三级结构的预测为此酶的结构功能研究和新型抗囊虫药物的开发奠定了基础。