鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因的表达及免疫原性研究

为探索鸡传染性贫血重组蛋白亚单位疫苗的可行性,将鸡传染性贫血病毒基因分别克隆到转移载体p Fast Bac HTA中,再将其分别转化DH10Bac感受态细胞得到相应的重组表达载体,转染昆虫细胞Sf21获得含有VP1、VP2基因的重组杆状病毒v Bac-VP1、v Bac-VP2,应用悬浮培养的Sf21细胞表达重组蛋白。SDS-PAGE及Western blotting结果证明,VP1、VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,动物试验进一步证实,重组蛋白免疫SPF鸡可产生ELISA抗体,提示杆状病毒表达的VP1、VP2具有良好的免疫原性。     

猪瘟病毒E~(rns)和E2基因在昆虫细胞中的表达研究

利用昆虫细胞/杆状病毒系统表达猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)Erns和E2基因,用于CSFV新型疫苗以及建立相关的血清学诊断方法等研究.从猪瘟病毒石门株血液样品中提取总RNA,对Erns及E2基因进行扩增,将产物回收后分别连接于T载体,酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移载体pFastBac HT经重组筛选后获得杆状病毒重组质粒,重组质粒转染昆虫细胞sf9后连续传3~4代,分别收获细胞上清液及沉淀,用于SDS-PAGE及Western-blotting试验,检测重组Erns,E2基因表达蛋白.用抗组氨酸(His)单克隆抗体在表达细胞中检测到Erns重组的His标签蛋白;应用抗E2蛋白单克隆抗体在表达细胞及培养上清液中检测到E2基因表达蛋白.结果表明在杆状病毒系统中成功表达了CSFV Erns和E2蛋白.     

柞蚕杆状病毒诱导鸡异嗜白细胞脱粒效应的信号转导通路

通过探讨柞蚕(Antheraea pernyi)杆状病毒诱导鸡异嗜白细胞的信号转导途径,确证其是否具有活化鸡异嗜白细胞的作用。采用β-葡萄糖苷酸酶释放法检测柞蚕杆状病毒诱导的鸡异嗜白细胞脱颗粒反应,并通过应用蛋白酪氨酸激酶(src、syk)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)以及丝裂原活化蛋白激酶(ERK、p38 MAPK、JNK)的特异性抑制剂,分析各蛋白酶通路在柞蚕杆状病毒诱导鸡异嗜白细胞脱粒反应中的作用。结果表明,柞蚕杆状病毒可以显著提高鸡异嗜白细胞的脱粒反应,其中src、PI3-K、JNK的特异性抑制剂能够抑制柞蚕杆状病毒诱导的鸡异嗜白细胞的脱粒反应,而syk、ERK、p38 MARK的特异性抑制剂则对鸡异嗜白细胞脱粒不起作用,说明柞蚕杆状病毒可通过src→PI3-K→JNK信号转导通路来诱导鸡异嗜白细胞的脱粒反应。     

RNA干扰技术和家蚕杆状病毒表达系统在纤维素酶研究中的应用前景

植物通过光合作用产生的纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。纤维素酶是糖苷水解酶的一种,能有效地将农作物秸杆等富含纤维素的物质水解为葡萄糖,进而发酵产生生物乙醇,从而解决农业、再生能源以及环境污染等问题。随着生物化学、分子生物学以及基因工程等多种交叉学科的快速发展,获得适合工业化的高活力的纤维素酶指日可待。RNA干扰是利用双链RNA特异性地降解相应序列的mRNA,从而特异性地阻断相应基因的表达,是后基因组时代的一种强有力的调控目的基因表达的实验工具。家蚕杆状病毒表达系统是一种快速、高效表达外源基因的技术手段,目前该系统的发展和应用已经非常成熟。本文综述了纤维素酶的特性以及近年来国内外对纤维素酶、RNA干扰和家蚕杆状病毒表达系统的研究进展,并对该两种实验技术手段在今后纤维素酶研究中的应用前景作了预测和展望。     

口蹄疫病毒VP1基因密码子偏好性分析

VP1蛋白是口蹄疫病毒(FMDV)的主要结构蛋白,可诱导机体产生中和抗体以及激发保护性免疫应答。为探究VP1基因密码子偏好性,筛选出其最佳体外表达系统,使用Visual Gene Developer、CodonW、GraphPad Prism等软件,对VP1基因进行密码子偏好性分析,同时将VP1基因密码子使用频率与大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统作了比较。结果显示,VP1基因的CAI为0.21,ENC为55.43,GC3S为65.26%,表明该基因密码子使用偏好较弱并且密码子偏好以G/C碱基结尾。结合VP1基因与各表达系统密码子使用频率比值,发现其与昆虫杆状病毒表达系统频率比值差异最小且CAI最大,因此推断昆虫杆状病毒表达系统是FMDV VP1基因最适体外表达系统。本研究为FMDV亚单位疫苗研制等提供了技术基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒表面的展示

本试验将猪圆环病毒2型(PCV2)去核定位区ORF2基因克隆到杆状病毒表面展示转座载体pBacSC中,转化DH10Bac大肠杆菌感受态,经抗性及蓝白斑筛选得到含ORF2基因的重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法将此重组DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。对重组病毒进行Western-blot分析和免疫金电子显微镜检测。结果表明,PCV2 Cap蛋白在重组杆状病毒中获得表达;免疫金电子显微镜观察表明,重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上。本试验成功构建表面展示PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用重组杆状病毒作为亚单位疫苗奠定基础。     

水稻瘤矮病毒髓和S8基因共表达杆状病毒转移载体构建及重组病毒的鉴定

为构建携带水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus，RGDV）主要内层衣壳蛋白53基因和外层衣壳蛋白鼹基因的重组杆状病毒，将目的基因（S3和S8）分别亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual多角体启动子（PH）和plO启动子的下游．经酶切和确证性序列测定，将其转化到DHl0Bac感受态细胞中，获得重组杆粒rbpFBDS3-S8，采用脂质体转染法，将rbpF-BDS3-58转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Si9细胞包装病毒，PCR筛选鉴定重组病毒．结果表明：SD昆虫细胞被侵染72h后，倒置显微镜下观察到细胞增大，培养液和细胞内出现颗粒状物质，部分细胞破裂甚至裂解，说明53和S8基因已整合到重组杆状病毒基因组中，这为开展RGDV主要结构蛋白在昆虫细胞中的表达及其功能研究奠定了基础．     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人瘦素蛋白

瘦素(leptin)蛋白由肥胖基因编码,对人体能量代谢等多种生理过程起着重要的调节作用。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人瘦素蛋白基因(lep)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,并转化E.coli DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-lep,然后转染家蚕BmN细胞,获得重组杆状病毒。用SDS-PAGE和Western blotting方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞检测到大小约22 kD的蛋白条带,与预期的人瘦素蛋白分子质量相符。给家蚕5龄起蚕注射重组病毒液后的4～5 d出现发病症状,RT-PCR检测发病家蚕的血液中有lep基因转录,并通过SDS-PAGE和Western blotting检测到大小为22 kD的人瘦素蛋白的表达。研究结果表明,利用Bac-to-Bac表达系统能够获得含有人瘦素蛋白基因的重组杆状病毒,并且目的蛋白能在家蚕细胞及幼虫体内表达。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在重组杆状病毒中的表达及鉴定

为获得J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的gp85蛋白,将ALV-J的gp85基因克隆至pFastBac-HTA供体质粒,将其转入DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,使gp85基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建重组穿梭载体Bacmid-gp85。通过脂质体介导,将重组穿梭载体Bacmid-gp85转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacgp85。Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定结果表明ALV-J gp85蛋白在Sf9昆虫细胞中得到正确表达,表达的重组gp85蛋白分子量约为38 ku。ALV-J gp85重组蛋白在Sf9细胞中的正确表达为其功能研究和应用提供了良好的基础。     

水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV) VP2 基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEV VP2 基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10 Bac感受态细胞,获得重组Bacmid 质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行 Western blotting鉴定。结果成功克隆MEV VP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在 Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。