天祝白牦牛HSP60基因的克隆及其在下丘脑-垂体-睾丸中的表达定位研究

热休克蛋白60(HSP60)不仅在细胞保护方面发挥作用,也参与雄性动物生殖生理的调控。为研究HSP60基因序列特性及其在天祝白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴(HPT-axis)上的表达情况,探寻其在白牦牛睾丸发育、精子发生过程中的作用机制,本研究采用RT-PCR和RACE技术获得白牦牛HSP60基因全长cDNA序列,采用生物信息学方法分析HSP60蛋白的理化性质、结构及不同物种之间的同源性等,并利用qPCR、Western blotting、免疫组化法分析HSP60在白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴中的表达及定位。结果表明,白牦牛HSP60基因cDNA全长为2 300 bp,开放阅读框为1 722 bp,编码572个氨基酸;其理论分子量为60.977k Da、等电点为5.69,编码的蛋白为非跨膜可溶性蛋白。氨基酸序列比对结果显示,白牦牛HSP60氨基酸序列与牛、瘤牛、绵羊、藏羚羊、骆驼、白犀牛、兔和黑猩猩的氨基酸序列同源性高、进化水平相近。HSP60基因及蛋白在白牦牛的下丘脑、垂体及睾丸组织中均有表达,其中下丘脑及垂体组织表达量显著高于睾丸,下丘脑和垂体之间差异不显著。免疫组化结果显示,HSP60蛋白定位表达于白牦牛下丘脑组织的室旁核大细胞、室旁核小细胞和神经角演网、垂体组织的腺细胞、睾丸组织的精原细胞、精母细胞、支持细胞和间质细胞,而精子细胞中表达较弱。通过对健康成年白牦牛HSP60在下丘脑-垂体-睾丸轴的表达与定位检测,推断HSP60参与雄性白牦牛生殖轴调控,并参与睾丸发育与精子发生。本研究结果为进一步研究HSP60对雄性生殖调控奠定了基础。     

圆果黄麻纤维素合成酶基因CcCesA1的克隆、反义载体构建及转化拟南芥

以圆果黄麻(Corchorus capsularis L.) “179”茎部韧皮为材料，利用同源克隆和RACE技术，克隆黄麻纤维素合成酶基因CcCesA1 5¢端500 bp序列外的全部cDNA。其序列长度为2529 bp，编码627氨基酸残基，经Blast基因比对和蛋白质结构分析，确定是黄麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析表明，CcCesA1在植株不同部位表达量具组织差异性，依次为茎部韧皮>根>叶>顶芽>麻骨。利用CcCesA1基因部分cDNA序列和3¢UTR区，构建黄麻CcCesA1基因反义载体，用测序验证的阳性质粒转化模式植物拟南芥。Southern结果表明，外源基因以单拷贝方式整合进入基因组，转基因拟南芥生长严重受阻，植株变得矮小且茎部易弯曲倒伏，角果数量变少，长度变短，纤维素含量有不同程度的降低，本研究结果表明，所克隆的黄麻CcCesA1基因除了参与植物其他生理代谢过程外，还参与纤维素的生物合成。     

Relationship between three novel SNPs of BRCA1 and canine mammary tumors

The BRCA1 gene plays an important role in the development of human breast cancer, and recent research indicated that genetic variations of BRCA1 are also related to canine mammary tumors (CMTs). Here, using rapid amplification of cDNA ends (RACE), we cloned the 5′- and 3′-UTRs of BRCA1. By direct sequencing of the flanking sequences of the 5′- and 3′-UTRs of BRCA1, three previously unreported single-nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified, two (−1228T >C, −1173C >T) in the putative promoter regions and one non-synonymous SNP (63449G >A) in exon 23. Compared with 16 normal samples, the sequences from 34 CMTs suggested that SNP (−1173C >T) was associated with the development of CMTs (odds ratio (OR)=2.57, 95% confidence interval (CI): 1.07–6.15).     

哈茨木霉天冬氨酸蛋白酶基因SA76的3＇RACE扩增和序列分析

由EST获得全长cDNA对于结构基因组学和功能基因组学都是至关重要的,cDNA末端快速扩增技术RACE是该领域中的重要研究方法.利用BD SMART RACE技术扩增编码分泌天冬氨酸蛋白酶SA76基因的3＇末端,将其与哈茨木霉cDNA文库中的SA76基因的EST序列进行序列拼接,获得2019bp的全长cDNA序列,其开放读码框长1593bp,5＇非编码区266bp,3＇非编码区201bp,编码530个氨基酸,有信号肽.哈茨木霉天冬氨酸蛋白酶基因与玉蜀黍赤霉、粗糙脉孢菌、球毛壳菌天冬氨酸蛋白酶基因的同源性分别为53%, 37%, 36%.利用BD SMART RACE技术首次从哈茨木霉中克隆天冬氨酸蛋白酶基因,为验证SA76基因的功能奠定基础,为进一步研究蛋白酶的作用机制及生物防治功能提供依据.     

小地老虎V-ATP酶A亚基基因的克隆与分析

V-ATP酶是一种ATP依赖型的多亚基质子泵,广泛存在于多种生物的内膜和质膜上,参与生物体内多种重要的生理生化反应,为了进一步研究V-ATP酶,克隆小地老虎V-ATP酶A亚基基因。以鳞翅目昆虫小地老虎(Agrotis ypsilon)的中肠组织为材料,利用RACE技术克隆小地老虎V-ATP酶A亚基基因全长。结果表明:克隆得到A亚基基因序列2 693bp,其中CDS区1 851bp,编码616个氨基酸,翻译的蛋白质分子质量为68.06ku,等电点为5.14,含有3个N-糖基化位点。基因同源性分析结果说明该基因与棉铃虫(Helicoverpa armigera)、烟草天蛾(Manduca sexta)、小菜蛾(Plutella xyllostella)均有较高的同源性。A亚基基因序列已提交至GenBank并获得登录号KM434187。     

2个野扁桃自交不亲和SFB基因全长的克隆与序列分析

为给野扁桃的遗传改良和自交不亲和机制的进一步研究提供理论依据,以新疆野扁桃花药为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆野扁桃自交不亲和性花粉特异性决定因子编码基因SFB全长序列。采用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,CDD分析蛋白保守结构域,Prot Param分析蛋白理化性质,TMHMM预测蛋白跨膜区,Signal P预测蛋白信号肽,Sub Loc预测蛋白亚细胞定位,SOPMA分析蛋白二级结构,DANMAN进行氨基酸多序列比对,MEGA6进行系统进化分析,Prot Fun预测蛋白功能。结果表明:克隆到的Pt SFB16基因和Pt SFB17基因属于F-box基因家族,与其它多种植物的SLF/SFB基因的序列相似度为88%,推导的氨基酸序列均具有F-box蛋白典型结构;Pt SFB16基因ORF长1 146 bp,编码381个氨基酸,Pt SFB17基因ORF长1 131 bp,编码376个氨基酸;预测2个SFB蛋白均为略显亲水性、不稳定的细胞质蛋白,二级结构均以α-螺旋,延伸链和无规则卷曲为主,SFB/SLF蛋白在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,种间同源性可能大于种内同源性,SFB蛋白可能的功能主要有辅助因子生物合成、能量代谢和裂合酶。     

水稻干尖线虫SPRYSEC基因的克隆及表达定位分析

根据水稻干尖线虫转录组测序结果,采用c DNA末端快速扩增技术(RACE法)从水稻干尖线虫中克隆到效应因子SPRY同源基因,并将其命名为Ab–SPRYSEC(NCBI登录号为KT188820)。该基因全长为2 089 bp,包含1个1 962 bp的开放阅读框(ORF)。预测蛋白编码653个氨基酸,相对分子质量为72 009,理论等电点为4.82,不稳定指数为41.5,属于不稳定性蛋白。保守区预测分析结果表明,该蛋白含有B302_SPRY和CTLH 2个保守结构域,属于SPRY超家族。多序列比对分析结果表明,该基因编码蛋白与马来丝虫的SPRY(XP_001891979.1)蛋白的相似度为43%。蛋白结构分析结果表明,β–折叠与无规则卷曲是Ab–SPRYSEC蛋白的主要结构元件。表达定位分析结果表明,Ab–SPRYSEC基因的表达位置在水稻干尖线虫食道腺附近。Ab–SPRYSEC基因作为水稻干尖线虫效应因子,在水稻干尖线虫侵染宿主中发挥了重要作用。     

谷子弯孢病菌Clga-1基因克隆及特征分析

谷子弯孢病菌(Cochliobolus lunatus)引起的谷子叶斑病是谷子生产上的重要病害之一,常造成严重经济损失.本研究利用候选基因法和RACE技术克隆了谷子弯孢病菌中的1个Ga基因,命名为Clga-1,在GeneBank登陆号为HQ699081.Clga-1基因开放阅读框为l 062 bp,编码353个氨基酸多...     

南方根结线虫延长因子2基因cDNA全长克隆和序列分析

以南方根结线虫为材料，根据同源序列法分别进行3′末端和5′末端的RACE，获得延长因子基因2 cDNA全长。此cDNA全长序列为2434 bp，包括2334 bp的完整ORF，编码一含777个氨基酸的多肽。该基因命名为Mi-eft2，其推导蛋白MI-EFT2的编码氨基酸与秀丽隐杆线虫的Ce-eft1，Ce-eft2，Ce-eft3，Ce-eft4基因的推导蛋白的同源性分别为26.7%、86.9%、13.8%和8.9%。蛋白功能分类预测MI-EFT2是一种在蛋白质延长过程中起作用的GTP水解酶，与真核生物的延长因子2功能相同。     

棉花盐胁迫应答基因GhCPK5的克隆及序列分析

本研究克隆了1个陆地棉新的钙依赖蛋白激酶基因GhCPK5(Genbank登录号为:HM002634)。GhCPK5基因组DNA序列全长3 031 bp,包含一个1 707 bp的开放阅读框,具有7个外显子和6个内含子。GhCPK5可能定位于细胞核内,有568个氨基酸残基,分子量为63 ku。氨基酸序列分析表明,陆地棉GhCPK5与杨树PtCPK5同源性达到89%,同样包含完整的激酶结构域和4个EF-hand结构域。RT-PCR分析表明,该基因在根、茎、叶等组织中表达;在盐胁迫处理下,GhCPK5在各组织的表达量明显上升。