狂犬病病毒SRV9克隆株核蛋白基因的克隆、表达与特性分析

根据已发表的狂犬病病毒核蛋白基因序列，设计并合成了一对引物，从SAD株驯化的SRV9。蚀斑株中提取病毒RNA，通过RT-PCR扩增出核蛋白的全长cDNA序列，测序结果显示，其序列与国外报道的SAD母源株序列一致。将核蛋白的cDNA克隆至原核表达载体pET-28b( )中，转化大肠杆菌BL21（DE3）plyss，于30℃1mmol/LIPTG条件下诱导表达，大肠杆菌菌体裂解产物经SDS-PAGE分析，在分子量约为56kDa处出现一新的蛋白带。和预期的目的蛋白分子量相符，Western-blotting检测表明，表达产物能与狂犬病病毒阳性血清发生特异性反应，出现单一反应带，扫描分析显示，表达产物占菌体总蛋白的23%，包涵体分离，纯化后，纯度达89%，上述结果为核蛋白在狂犬病基因免疫和免疫检测中的进一步应用奠定了基础。     

禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因,其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致,与其它毒株则有较大差异,说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中,再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中,经过三次蚀斑筛选,获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ,结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。     

禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术的研究

用表达禽流感病毒（ＡＩＶ）核蛋白基因的杆状病毒感染Ｓｆ９昆虫细胞。以其表达产物制备抗原,建立了以杆状病毒系统表达的ＡＩＶ核蛋白为抗原的禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术（ｒＮＰ－ＥＬＩＳＡ）。其抗原最适包被量为０．６μｇ／孔,等检血清最适稀释度为１：２００,酶标抗体使用浓度为１：１０００。根据对１４０份ＳＰＦ鸡血清检测结果的统计分析,确定其判定标准为ＯＤ均为阴性;检测Ａ型ＡＩＶ１５个不同亚型（Ｈ１￣Ｈ１５）毒株的特异性血清均为阳性;对人工接种ＡＩＶ的ＳＰＦ鸡第３天即能检出抗体,到第１６２天试验结束时检测仍为阳性。其批内和批间重复试验的变异系数分别在２．９％￣７．２％和３．４％￣９．８％之间。对３１３８份鸡血清进行监测,ｒＮＰ－ＥＬＩＳＡ与全病毒间接ＥＬＩＳＡ与全病毒间接ＥＬＩＳＡ（ＡＩＶ－ＥＬＩＳＡ）、琼脂扩散     

禽流感病毒分离株A/Chicken/Xinjiang/1/96(H14N5)NP基因序列分析

对ＲＴＰＣＲ扩增的禽流感病毒Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｘｉｎｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）分离株核蛋白基因进行了序列分析。结果表明：所克隆的基因包含了全部核蛋白阅读框架,编码区为１４９４个核苷酸。比较性研究表明,该毒株与Ａ／Ｍａｌａｒｄ／Ａｓｔｒａｋｈａｎ（Ｇｕｒｊｅｖ）／２６３／８２（Ｈ１４Ｎ５）有很高的同源性,而与人流感病毒株有较大,显示出明显的禽流感病毒特征。     

牦牛和雄性不育杂交后代睾丸组织差异表达核蛋白的双向电泳分析

研究比较牦牛(Bos grunniens)和犏牛睾丸核蛋白的表达差异,以探索公犏牛不育的分子机制。提取牦牛(n=4)和犏牛(n=4)睾丸的核蛋白,采用双向电泳分离后,对差异表达蛋白质点进行质谱鉴定。通过分辨率高、重复性好的睾丸组织核蛋白双向电泳图谱,检测出在牦牛和犏牛睾丸存在2倍及以上差异表达的蛋白点15个,通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定得到13种差异表达蛋白,大多数为核蛋白,在犏牛睾丸中表达显著下降,另外还包括4种核不均一蛋白(hnRNPs)。这些蛋白质参与精子发生、前体RNA加工和选择性剪接、基因表达调控等过程,其表达的改变可能与犏牛精子发生障碍有关。     

狂犬病病毒核蛋白基因的克隆序列分析及其在E.coli中的高效表达

对狂犬病病毒（RV）ERA株核蛋白（N）基因进行了克隆和序列分析。根据GenBank中已发表的RVN基因序列，设计合成了1对特异性引物，对RV ERA株N基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pMD18T连接得到重组质粒pMD-N，并进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1353bp，编码450个氨基酸。RV ERA株与CVS-11、PV-11、SRV9和SAD—B19株相比，核苷酸的同源性分别为98％、98．3％、99％、99.6％，推导的氨基酸的同源性分别为98％、99％、99％、99.6％。将pMD-N双酶切，回收目的基因片段并克隆到原核表达载体pET28a（＋）中，构建了重组质粒pETN；将其转化表达菌BL21（DE3）并用IPTG进行诱导表达。结果重组菌裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为53kDa的重组蛋白。经凝胶薄层扫描分析，重组蛋白表达量占菌体蛋白的56．8％，Western-blot结果显示该重组蛋白能与RV多克隆抗体发生特异性反应。     

禽流感A／鸡／北京／1／96（H9N2）株核蛋白基因克隆和序列分析

本研究采用ＰＴ－ＰＣＲ法从禽流感Ａ／鸡／北京／１／９６（Ｈ９Ｎ２）株克隆了核蛋白（ＮＰ）基因。ＮＰ基因全长１４９７ｂｐ,编码４９８个氨基酸。将其序列与数株Ａ型流感病毒ＮＰ序列进行比较,相互间同源性在９６．６％～９５．４％。这一结果为研究核酸探针和其它方法诊断禽流感奠定了基础     

表达禽流感HA和NP双基因重组禽痘病毒的免疫保护性

将分别来自禽流感病毒A／Goose／Guangdong／3／96(H5N1)毒株的HA基因和A／Goose／Guangdong／1／96(H5N1)NP基因重组到禽痘病毒基因组中，获得了能同时高效表达这两种蛋白的重组禽痘病毒(rFPV—HA—NP)。将rFPV—HA—NP经翅膀刺种途径接种8周龄SPF鸡，并设亲本禽痘病毒免疫和非免疫对照组。免疫后4周分别用10LD50的高致病力禽流感病毒(HPAIV)A／Goose／Guangdong／1／96(H5N1)和A／FPV／Rostock／34(H7N1)毒株进行攻击。结果重组禽痘病毒rFPV—HA—NP免疫鸡群后能够诱导产生高水平的特异性抗体，可完全抵抗H5N1毒株的致死性攻击，并可有效阻止H7N1病毒攻击后病毒在泄殖腔的排出。而禽痘病毒免疫组和非免疫对照组在攻毒后全部发病并死亡。结果表明NP在与HA共同表达时，在诱导交叉保护性方面有一定的免疫增强功能。     

SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达

对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对SARS病毒N蛋白基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-N,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp,编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100%。将pGEM-N双酶切,回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,构建了重组质粒pET-N;将其转化表达菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明:重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Western-blotting证实,重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43%。     

Fine mapping and conservation analysis of linear B-cell epitopes of peste des petits ruminants virus nucleoprotein

Nucleoprotein (NP) is the most abundant and highly immunogenic protein of morbillivirus, and is presently the basis of most diagnostic assays for peste des petits ruminants virus (PPRV). In this study, fine epitope mapping and conservation analysis of linear B-cell epitopes on the PPRV NP has been undertaken using biosynthetic peptides. Nineteen linear B-cell epitopes were identified and their corresponding minimal motifs were located on the NP of PPRV China/Tibet/Geg/07-30. Conservation analysis indicated that ten of the 19 minimal motifs were conserved among 46 PPRV strains. Peptides containing the minimal motifs were recognized using anti-PPRV serum from a goat immunized with PPRV vaccine strain Nigeria 75/1. Identified epitopes and their motifs improve our understanding of the antigenic characteristics of PPRV NP and provide a basis for the development of epitope-based diagnostic assays.