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1.
鳗源嗜水气单胞菌β—溶血素基因的克隆及表达   总被引:9,自引:2,他引:7       下载免费PDF全文
龚晖 《水产学报》2003,27(2):124-130
应用PCR技术,从1株鳗源嗜水气单胞菌ML316中扩增得到β 溶血素基因AHL316HEM,将AHL316HEM克隆到pGEM TEasyVector,经分析验证后重组到pcDNA3.0中,构建了重组质粒PDLH。转化重组质粒PDLH的大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α能在血琼脂培养皿中形成明显的β 溶血斑,重组菌纯化的胞外产物溶血价为1.28×104HU·mg-1,同时重组菌的胞外产物能被原始菌株的高免血清特异性地识别。结果证实,克隆到鳗源嗜水气单胞菌β 溶血素基因,重组质粒PDLH能够表达具有天然生物学活性的β 溶血素,为构建嗜水气单胞菌核酸疫苗奠定了基础。  相似文献
2.
草鱼Mx蛋白基因的克隆与原核表达   总被引:5,自引:0,他引:5  
根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA,回收纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector系统的T载体上。重组子的序列分析表明:所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp,编码240个氨基酸,包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明,草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性,其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高,为87.1%。将此基因改造后定向克隆至原核表达质粒pBV220,构建成重组草鱼Mx蛋白基因表达质粒pBVgcMx,并在大肠杆菌中获得高效表达,重组草鱼Mx蛋白的表达量占菌体总蛋白的26.6%。Q-sephrose FF层析柱分离纯化的重组草鱼Mx蛋白纯度达95.6%。  相似文献
3.
鳗源嗜水气单胞菌主要外膜蛋白基因克隆及其表达   总被引:5,自引:0,他引:5       下载免费PDF全文
欧阳岁东 《水产学报》2006,30(4):566-570
A pair of primers were designed according to the published nucleotide sequence of a putative outer membrane protein gene (omp) of Aeromonas hydrophila . With the specific primers, a target fragment about 1.1 kb was amplified from Aeromonas hydrophila ML316 via PCR .The target fragment was inserted into the linearized pGEM-T easy vector. After enzyme restriction and sequencing analysis,the nucleotide data had been further analyzed by DNAman and ClutalW software. The analysis results showed that the cloned DNA fragment had a longest open reading frame (ORF) of 1035 nt,it predicted to be encoded a 344 aa protein with the molecular weight of 36 kD. Hydrophobicity analysis suggested that the protein was highly hydrophilic, especialy at the first 24 aminoacid, this region could function as signal peptide. The homologious comparison proved the cloned gene had 96% homology to the sequence of the omp gene, and the alignment of the amino acid sequence was 98% . The recombinant plasmid was constructed with the target gene and the expressing vector pGEX-4T-1 and then was transformed into E. coli BL21(DE3)by BamH and Sal I .The fusion protein was expressed under the IPTG inducing condition,and exhibited about 62 kD in size,very close to the predicted molecular weight of GSTMOMP, furthermore,the fusion protein was specifically recognized by antiserum which raised against the major outer membrane protein of AHML316. Considering all these together, it proved that the cloned gene represented the major outer membrane protein gene of AHML316, and the expressed gene products shared identical antigenicity with the natural main outer membrane protein,and also provided technical support for developing an advanced gene engineering vaccine against Aeromonas hydrophila.  相似文献
4.
脊尾白虾热休克蛋白HSP70基因的克隆及其表达分析   总被引:5,自引:3,他引:2       下载免费PDF全文
韩俊英  李健  李吉涛  常志强  陈萍  李华 《水产学报》2011,35(8):1130-1138
克隆了脊尾白虾热休克蛋白基因全长cDNA,并进行了序列分析。该基因由2 250 bp的碱基组成,开放阅读框长1 959 bp,编码由652个氨基酸组成的蛋白,基因两翼分别存在83 bp(5′端)和208 bp(3′端)的非翻译区,将该基因命名为Ec-HSP70。与其它物种HSP70s氨基酸序列进行同源性比较发现,与甲壳动物的同源性都在90%以上,表明该蛋白属于热休克蛋白HSP70家族。聚类分析表明,脊尾白虾热休克蛋白氨基酸序列与中国明对虾和凡纳滨对虾紧密聚为一支,之后聚类顺序依次为斑节对虾、日本囊对虾、刀额新对虾等。通过荧光定量RT-PCR对该基因在肝胰腺、肌肉的表达分析表明,温度、pH和氨氮胁迫都可以引起该基因的高表达,而且肝胰腺中的高表达时间相对肌肉中出现的较早。试验结果表明,温度、pH和氨氮胁迫对脊尾白虾HSP70基因表达有一定的诱导效果,但胁迫的时间过长则抑制其表达,肝胰腺对胁迫比肌肉较敏感。  相似文献
5.
暗纹东方鲀mtDNA的分离纯化及其细胞素b基因的分子克隆   总被引:4,自引:0,他引:4  
利用改进的差速离心法和碱裂解法制备并分离纯化了暗纹东方纯mtDNA,测得分子大小为19.4Kb。用线粒体特异染色法跟踪和监测线粒体提取,结果表明,25000-35000g能获得90%以上的高得率。利用制备纯化的mtDNA,已首次克隆了暗纹东方纯细胞色素b基因(cytb)。  相似文献
6.
黄海黄杆菌YS-9412-130具有稳定的分泌低温碱性蛋白酶的能力。将其染色体DNA用Sau3AⅠ部分酶切后,低熔点琼脂糖回收2-10Kb的DNA片段,用Klenow大片段酶半补齐,与用SalⅠ酶切且半补齐的质粒pUC19连续后,转化E.Coli.JM109,构建基因文库。且酪蛋白平板法和酶联免疫吸附(ELISA)的活性筛选方法从基因文库中筛选到一株产海洋低温碱性酶的阳性克隆(命名为pHH1)。序列测定分析表明,此重组质粒包含有长度为768bp低温碱性蛋白酶基因的完整的开放读码框架(ORF)和上游基因调控序列。此片段编码由256个氨基酸组成的酶,计算分子量为83000Dal。通过Southern杂交证实了此片段来自于黄海黄杆菌YS-9412-130基因组DNA。  相似文献
7.
中华绒螯蟹RXR基因全长cDNA克隆及表达分析   总被引:4,自引:2,他引:2       下载免费PDF全文
维甲类X受体(retinoid X receptor,RXR),属于核受体超家族(nuclear receptor super family)成员,是一种重要的调控因子,对甲壳动物生长发育和繁殖具有十分重要的作用。本研究根据陆地蟹 RXR基因保守区序列设计上下游引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)RXR基因并进行各组织间的表达分析。序列分析表明中华绒螯蟹RXR cDNA全长1517bp,编码433个氨基酸。经BLASTn和BLASTx分析表明,中华绒螯蟹RXR氨基酸序列与陆地蟹RXR基因的氨基酸序列相似性最高,为96%。系统进化树分析显示,中华绒螯蟹RXR的氨基酸序列与陆地蟹RXR聚为一支。荧光定量PCR结果显示,RXR在所有检测的组织中均有表达,且在中华绒螯蟹Y器官中表达量最高,肝胰腺、鳃和肌肉中有少量表达,心脏、胃、肠、胸神经节和脑神经节中微量表达。在中华绒螯蟹不同蜕皮时期中,Y器官中RXR表达量在D期最高,与AB期、C期呈显著性差异(P<0.05);肌肉中RXR在AB期表达量最高,与其他蜕皮时期呈显著性差异(P<0.05);肝胰腺和鳃中RXR在AB期表达量最高,E期表达量最低,但各蜕皮时期表达量之间差异不显著。  相似文献
8.
储卫华 《水产学报》2004,28(1):84-88
根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列,设计和合成了一对引物,以嗜水气单胞菌AhJ—1的基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段,并克隆到质粒载体pGEM—T中进行测序和分析,结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87%,扩增片段编码343个氨基酸,推测的分子量为35700,计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性,可作为核酸疫苗的侯选基因片段。  相似文献
9.
虎纹蛙病毒主要衣壳蛋白基因的克隆及其序列   总被引:3,自引:0,他引:3       下载免费PDF全文
苗素英 《水产学报》2001,25(6):559-563
从新分离感染虎纹蛙的病毒培养细胞中提取病毒DNA作模板,用分别对应于蛙病毒-3型(FV3)主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因读码框两侧的寡核苷酸片段作引物进行PCR扩增,得到预期大小基因片段,进一步将此基因片段插入到pGEM-T载体中,进行全长片段的序列测定和分析。结果表明,编码虎纹蛙病毒的MCP基因的读码框核苷酸数为1392bp,编码463个氨基酸;基因的核苷酸序列与其他脊椎动物虹彩病毒的MCP基因序列比较结果显示,该病毒与蛙病毒属的FV3的同源性(98%)明显高于囊肿病毒属的FLDV-1(52%),并且与虹彩病毒科其他成员的MCP基因序列均有所不同,说明该病毒株是虹彩病毒科蛙病毒属的新成员。  相似文献
10.
嗜水气单胞菌温敏胞外蛋白酶基因eprJ的克隆与检测   总被引:2,自引:0,他引:2  
根据已发表的人源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)温敏胞外蛋白酶基因eprA1的核甘酸序列,设计合成一对引物,以嗜水气单胞菌鱼源株Ah J-1基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到1 005 bp的胞外蛋白酶基因eprJ1,将该基因片段连接到pMD18-T载体中,构建克隆载体pMD-eprJ1。序列分析发现,其与发表的Ah AH1的胞外蛋白酶eprA1基因的同源性有91%。根据测序结果在保守区重新设计一对引物以增强特异性,扩增片段大小为387 bp。对1990~2004年15年间从浙江、福建、湖北及江苏等地不同患病水产动物肝肾等脏器分离到的23株Ah检测结果显示,从中国东南地区分离的21株Ah水生动物致病性菌株扩增均为阳性,2株Ah非致病性菌株为阴性,推测该基因普遍存在于致病性Ah中。检测模板DNA的灵敏度可达1.5×10-3ng/μL。  相似文献
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