脊尾白虾热休克蛋白HSP90基因的原核表达与鉴定

将脊尾白虾热休克蛋白90基因克隆到原核表达载体pET-30a中,经酶切验证和DNA测序鉴定后,将重组质粒转化表达宿主大肠杆菌Rosetta,优化温度、时间、IPTG和OD600表达条件进行诱导表达,收集菌液,进行SDS-PAGE和质谱检测,并用Quantity one软件分析蛋白表达水平。结果表明,成功构建了含脊尾白虾HSP90基因的重组表达载体pET-30a-HSP90,表达目的蛋白相对分子量为82.7kD,为HSP90蛋白。通过条件优化认为重组菌株Rosetta/pET-30a-HSP90的最佳诱导温度为37℃,最佳IPTG浓度为1.0mmol/L,最佳诱导时机和诱导时间分别为0.58h、7h。     

用核酸探针技术检测脊尾白虾体内的白斑综合症病毒

用斑点杂交和原位杂交检测了从病虾池捕获的脊尾白虾体内的WSSV。8尾脊尾白虾的斑点杂交检测阳性率为100%;脊尾白虾胃的上皮组织和结缔组织、位于鳃区头胸甲处的角化上皮、头胞甲反缘与虾体相连的角化上皮、结缔组织、附肢外的角化上皮、鳃丝的柱状上皮及其腔隙内的血淋巴、肝胰腺小管间的上皮组织及其血窦内的血淋巴、头胸甲的肌肉、造血组织、脊尾白虾精荚之结缔组织细胞、卵巢的结缔组织及其滤泡细胞原位杂交呈阳性。以上结果进一步证实了脊尾白虾是WSSV的天然宿主。     

盐度对脊尾白虾存活、生长和蜕壳的影响

研究了盐度突变对脊尾白虾成活的影响,以及水体盐度(0、6‰、12‰、18‰)对单个体养殖条件下脊尾白虾生长、成活和蜕壳的影响.结果表明:(1)盐度由6‰到0的突变组,脊尾白虾的成活率最低,96 h成活率仅为6.67％;而盐度由6‰至12‰、18‰的突变组,96 h的成活率均在93％以上.(2)单个体养殖试验结果表明,随着水体盐度提高(盐度0～12‰条件下),脊尾白虾最终体长、总体长增长率和成活率均有增加趋势;盐度超过12‰时,总体长增长率显著下降,但成活率变化不大.(3)盐度对脊尾白虾的蜕壳周期有一定影响,盐度12‰组虾的第1次、第5次、第8次和第9次蜕壳周期最长;整体上,盐度12‰组平均蜕壳周期最长(9.57 d),盐度0组平均蜕壳周期相对较短(8.47 d).因此,脊尾白虾对盐度低于6‰的水体适应性较差,盐度12‰有利于提高该虾的生长速度和成活率.     

脊尾白虾E75基因克隆及E75、ECR和RXR在不同蜕皮分期的表达分析

本研究在克隆脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)E75基因(EcE75,GenBank No.KY471317)的基础上,探讨了其在蜕皮过程中的作用,同时也探讨了克隆脊尾白虾的蜕皮激素受体基因(EcECR)和维甲酸X受体基因(Ec RXR)在不同蜕皮分期的表达特征。克隆的EcE75基因全长为3944 bp,包括2520 bp的开放阅读框(ORF)。该开放阅读框编码一个由839个氨基酸组成的蛋白质,分子量为92.307 k Da,理论等电点为7.48。EcE75蛋白包含1个C4锌指结构,1个配体结合结构域,并且有1个明显的跨膜螺旋。EcE75基因在进化上具有一定的保守性,与甲壳动物聚为一支,与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、黑背地蟹(Gecarcinus lateralis)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)等亲缘关系最近。EcE75基因在脊尾白虾的各组织中均有表达,其中,眼柄中的表达量最高,卵巢次之。在不同蜕皮分期中,EcRXR与EcECR、EcE75的表达规律基本一致,生殖蜕皮前期和后期表达量都比生长蜕皮高。生长蜕皮和生殖蜕皮因为卵巢发育而存在明显不同,蜕皮激素对卵巢发育的刺激作用,通过EcECR、EcRXR和EcE75基因的表达上调可以体现出来。对EcECR、EcRXR和EcE75基因在不同蜕皮分期的表达研究,为了解虾蟹类蜕皮机制提供了参考信息。     

脊尾白虾翻译控制肿瘤蛋白基因TCTP克隆及自噬调控相关基因在卵巢发育期的表达

为深入了解脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢发育和卵黄蛋白原发生的分子机制,本研究克隆得到脊尾白虾翻译控制肿瘤蛋白基因TCTP,并结合自噬调控基因TCTP、Hif-1α、Beclin1和Bcl-2在卵巢发育期的表达水平,阐释脊尾白虾卵黄蛋白原合成过程中的分子调控特征。研究显示,脊尾白虾TCTP基因c DNA全长为732 bp,编码168个氨基酸,具有典型的TCTP1和TCTP2功能域以及PKC和TKⅡ等mTOR信号通路相关的磷酸化位点。同时发现,甲壳动物TCTP普遍缺乏在其他动植物中高度保守的C末端的cys残基。进化分析显示,脊尾白虾TCTP与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)亲缘关系最近。4种自噬调控基因在脊尾白虾卵巢发育期的表达结果显示,肝胰腺TCTP基因从增殖期到产后恢复期呈递减趋势;肝胰腺Hif-1α、Beclin1和Bcl-2基因表达趋势相似,即从增殖期到小生长期高表达,大生长期极显著下降,表达量最低(P0.01),这与外源性卵黄蛋白原的合成趋势大致相反。这些自噬调控基因可能通过自噬作用共同调节外源性卵黄蛋白原的合成。卵巢TCTP基因在小生长期表达量最高;卵巢Hif-1α基因从增殖期到产后恢复期持续升高,这与内源性卵黄蛋白原表达趋势相似;卵巢Beclin1基因在大生长期表达量最高,与脊尾白虾卵巢Ec R表达趋势相似,与卵巢Bcl-2基因表达趋势相反,这些自噬调控基因可能通过自噬作用共同促进内源性卵黄蛋白的合成。本研究表明,自噬调控基因TCTP、Hif-1α、Beclin1和Bcl-2在脊尾白虾卵巢发育时期相互协调共同作用,可能通过自噬作用调节脊尾白虾卵黄蛋白原的合成和卵巢发育。     

脊尾白虾不同发育期mtDNA拷贝数变化特征分析

为了解脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)在不同发育期线粒体基因组(mtDNA)拷贝数的变化特征,本研究共采集其8个时期(受精卵期、溞状幼体Ⅰ期、溞状幼体Ⅱ期、溞状幼体Ⅲ期、溞状幼体Ⅳ期、溞状幼体Ⅴ期、仔虾期和成虾期)的DNA样品,利用TaqMan实时荧光定量PCR技术,对上述各发育期单个细胞中的mtDNA拷贝数进行了测定。检测结果显示,脊尾白虾受精卵期、溞状幼体Ⅰ期、溞状幼体Ⅱ期、溞状幼体Ⅲ期、溞状幼体Ⅳ期、溞状幼体Ⅴ期、仔虾期和成虾期的mtDNA拷贝数的均值分别为2366、2648、2644、2873、3559、9948、6452和8872。进一步统计分析结果显示,mtDNA拷贝数与发育时间存在正相关性,相关系数为0.83。研究表明,随着脊尾白虾不断生长,其单个细胞中mtDNA拷贝数总体呈上升趋势。     

淀山湖日本沼虾、秀丽白虾资源量的周年动态变化研究

淀山湖虾类资源以日本沼虾(Macrobrachium nipponense)和秀丽白虾(Exopalaemon modestus)最为丰富,在淀山湖渔业中占重要地位,也是淀山湖渔民的主要经济来源。根据2010年8月—2011年8月对淀山湖虾类资源的调查结果,对淀山湖日本沼虾、秀丽白虾资源量的周年动态变化情况进行研究。结果表明:日本沼虾头胸甲长范围为7.05~47.07 mm,平均值为(22.192±1.650)mm,优势头胸甲长组为15.5~30.5 mm,占82.98%;秀丽白虾头胸甲长范围为9.10~38.7 mm,平均值为(21.221±1.598)mm,优势头胸甲长组为15.5~25.5 mm,占80.49%;日本沼虾资源密度在9月份和5月份两次达到峰值,3月份最低;秀丽白虾资源密度在8月份和4月份两次达到峰值,6月份最低;在空间上,不同湖区日本沼虾和秀丽白虾的资源量波动较大,在春季和冬季,敞水区资源量高于沿岸带,夏季和秋季沿岸带资源量高于敞水区,并且上半段湖区资源量整体高于下半段湖区的资源量。通过本研究为合理管理和有效开发淀山湖虾类资源提供依据,也为渔业主管部门划定增殖放流区域提供参考。     

新型风味素对养殖脊尾白虾海鲜风味的影响

运用感官分析和GC/MS技术研究了两种新型海洋风味素对养殖脊尾白虾的感官特征和海鲜风味的影响,以及在暂养过程中的吸收规律。在脊尾白虾室内暂养的饲料中添加从海藻中提取的两种新型风味素DBP和TBP,经过一段时间的暂养后分别测定其体内的风味素含量,并进行感官分析,对各个实验组的明度、色调、香味、风味、异味、滋味、味觉、弹性和嫩度等感官指标进行分析比较、打分,并对虾的色泽、嗅觉、味觉、触觉等感官特征进行整体的描述与评价。结果表明:脊尾白虾能通过饲料添加的途径吸收一定浓度的风味素,两种风味素在脊尾白虾体内的累积能力各不相同。在实验条件下,脊尾白虾肉中风味素TBP的最大累积量为754.5ng·g-1,而对DBP的最大累积量为172.2ng·g-1。感官分析表明,通过在暂养过程中添加适量的风味素TBP可提高脊尾白虾的总体口感和海鲜风味。在脊尾白虾肉中的TBP含量在162.6～451.8ng·g-1时,脊尾白虾具有最好的口感和海鲜味。     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda) 2-巨球蛋白cDNA全长的克隆和表达分析

根据本实验室前期获得的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda) α2-巨球蛋白基因EST序列,采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA end, RACE)技术克隆获得脊尾白虾α2-巨球蛋白基因cDNA全长,命名为Ecα2M基因。该基因全长4823 bp,由4413 bp的开放阅读框、64 bp的5?端非编码区以及346 bp的3?端非编码区组成。开放阅读框编码1470个氨基酸,分子量为163.0 kDa,理论等电点为5.03。序列分析显示,Ecα2M序列N端含有23个氨基酸组成的信号肽。同源性分析显示,脊尾白虾Ecα2M氨基酸序列与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii) α2M的同源性最高,达到80%。荧光定量PCR分析结果显示,Ecα2M基因在血细胞、肝胰腺、肌肉、鳃、卵巢、眼柄、胃及肠中均有表达,其中在血细胞中的相对表达量最高。感染鳗弧菌和WSSV后,脊尾白虾血细胞中Ecα2M的相对表达量于6 h达到最大值且显著高于对照组(P<0.05),肝胰腺中Ecα2M的相对表达量于3 h达到最大值且显著高于对照组(P<0.05),相对表达量变化具有明显的时间差异性。     

脊尾白虾14-3-3 基因cDNA 全长的克隆和表达分析

利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞cDNA文库中脊尾白虾14-3-3巨球蛋白基因EST序列,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆获得脊尾白虾14-3-3基因c DNA全长,命名为Ec14-3-3。该基因全长2905 bp,包含744 bp的开放阅读框,编码247个氨基酸组成的蛋白质,分子量为27.95 kD,理论等电点为4.65。同源性分析表明,脊尾白虾Ec14-3-3氨基酸序列与斑节对虾(Penaeus monodon)14-3-3的同源性最高,达到98%。荧光定量PCR分析结果表明,Ec14-3-3基因在血细胞、卵巢、肝胰腺等组织中均有表达,其中血细胞中Ec14-3-3相对表达量最高。感染鳗弧菌和WSSV后6 h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec14-3-3基因的表达量较对照组均显著增加(P0.05),且具有明显的时间差异性。本研究结果表明,Ec14-3-3基因在脊尾白虾免疫反应中发挥重要作用。