棘胸蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌的分离鉴定及其感染的病理损伤

2016年4月四川雅安一棘胸蛙(Quasipaa spinosa)养殖场暴发一种临床特征表现为白内障、体表溃疡和神经症状的传染病。为明确此次流行病病因,本研究进行了病原菌分离、人工感染、分离菌理化特性与16S rDNA基因序列分析。结果从患病蛙肝、脾、肾中分离到一株G^-短杆菌(CM160701);将其腹腔注射感染健康棘胸蛙表现出与自然发病蛙相似症状。该菌的LD₅₀为1.19×10⁶ cfu·只^-1;通过理化特性与16S rDNA基因序列分析鉴定分离菌为脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica);其对氟苯尼考敏感,对恩诺沙星、多西环素、阿莫西林等多种药物耐受。病理组织学观察发现,其感染对全身多组织器官造成损伤,表现出明显的变性、坏死和炎症反应,尤以脑、肝、脾、心和肾损伤严重。该研究证实了脑膜炎败血伊丽莎白菌是本次疫情的病因,其感染引起棘胸蛙全身性损伤导致多组织器官功能障碍而死亡。     

First isolation and identification of Elizabethkingia meningoseptica from cultured tiger frog, Rana tigerina rugulosa

Elizabethkingia meningoseptica has been recognised as an occasional but serious opportunistic bacterial pathogen to human beings. Recently, it was frequently isolated from tiger frog, Rana tigerina rugulosa, with cataract disease, which is the most common disease of unknown aetiology of frogs in Hainan, China. The purpose of this study was to identify and characterise the bacterial strains isolated from the recent outbreaks of cataract disease in farmed tiger frog in Hainan, China, and to evaluate their pathogenicity to the frog and their sensitivity to 20 chemotherapeutic agents.The 16S rRNA gene sequences of strains W0701 (1478 bp), W0702 (1477 bp) and W0703 (1478 bp) showed 98.6–98.7% similarity with the sequence of E. meningoseptica type strain (ATCC 13253) and 99.9–100% similarity with that of E. meningoseptica NTU 870424-IL. Six strains (W0701–W0706) were selected to represent 24 isolates retrieved from six moribund frogs. The morphological, physiological and biochemical characteristics of the six representative isolates were consistent with those of E. meningoseptica strains. The organisms were only susceptible to vancomycin and moderately susceptible to cefoperazone among the 20 investigated chemotherapeutic agents. Virulence test with strain W0702 was conducted and pathogenicity (by intramuscular injection) was demonstrated in the tiger frog. In conclusion, 24 isolates obtained from frogs with cataract disease were the E. meningoseptica strains highly pathogenic to tiger frog, and this is the first report of E. meningoseptica as a pathogen for tiger frog.     

外膜蛋白OmpA在蛙源米尔伊丽莎白菌致病性中的功能

为探究外膜蛋白A（outer membrane protein A，OmpA）对米尔伊丽莎白菌致病作用的影响，以蛙源米尔伊丽莎白菌FL160902为研究对象，通过同源重组法构建OmpA缺失株△ompA，比较缺失株和野生株的生长特性、生物膜形成能力、抗血清杀伤能力、对细胞的黏附能力以及对蛙的致病性差异。结果显示：△ompA的生长能力和抗血清杀伤能力与野生株无显著差异；但与野生株相比，△ompA的生物膜形成能力增加了66%，△ompA对bEnd.3细胞的黏附能力降低了61%；黑斑蛙感染试验显示，△ompA在黑斑蛙血液、脾和脑组织中的载菌量分别为（3.15×10⁸±0.09×10⁸）、（2.11×10⁸±0.07×10⁸）和（6.61×10⁸±0.16×10⁸） copies/g，均显著低于野生株，且△ompA对黑斑蛙的致死率为37%，显著低于野生株的致死率（75%）。上述结果表明，ompA基因缺失不改变米尔伊丽莎白菌的抗血清杀伤能力，但增加了菌株的生物膜形成能力，减弱了菌株的黏附能力，从而降低了该菌对蛙的致病性。     

中华鲟脑膜败血伊丽莎白菌的分离鉴定及药敏特性研究

为了确定中华鲟养殖基地一尾死亡子二代中华鲟的病原,利用传统病原菌分离方法,从濒死的中华鲟肝脏、脾脏和腹水中均分离到一株优势菌EM,采用16S r DNA基因序列分析、构建系统发育树并结合Biolog微生物自动分析系统进行鉴定,确定菌株EM为脑膜败血伊丽莎白菌。进一步对健康子二代达氏鲟进行人工感染试验确定其致病性;同时通过观察患病子二代中华鲟组织切片分析其病理特征;并对菌株EM进行药敏特性研究以期指导临床用药。结果显示,被感染子二代中华鲟肝脏、脾脏及肾脏组织中铁血黄素沉积、实质性细胞空泡变性,溶血严重。菌株EM人工感染健康子二代达氏鲟,发现其对达氏鲟具有致病性,且从人工感染患病的达氏鲟肝脏中再次分离到相同的病原菌。药物敏感性试验表明,中华鲟脑膜败血伊丽莎白菌对米诺环素、克林霉素、克拉霉素和麦迪霉素4种药物敏感,对四环素、头孢噻肟和头孢西叮3种药物中度敏感,对其余28种药物不敏感,呈多重耐药性。本研究首次发现脑膜败血伊丽莎白菌可感染中华鲟,并对达氏鲟也具有致病性,并初步研究了病原菌的生物学特性、病理特征和药物敏感性,以期为该病的诊断和防治提供理论依据。     

蛙类歪头、破头与白眼综合征病原分析

为探明湖北、福建等主养区一系列蛙疾病的发病原因,从具有典型歪头、破头与白眼等症状的蛙脑部和内脏器官分离到40株优势菌。经16S rRNA 基因序列比对,发现40株优势菌均与米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)同源。经生理生化鉴定、系统发育分析发现,这40株优势菌存在遗传差异,宿主和区域是影响亲缘关系的重要因素,并判定菌株典型株QW08为米尔伊丽莎白菌。回归感染实验证实QW08为蛙类歪头、破头与白眼病的病原菌。组织病理学观察显示,米尔伊丽莎白菌感染黑斑蛙可引起其全身多脏器与组织损伤,脑、肠道、肝、脾与肾等组织器官损伤极其严重,主要病理变化表现为变性、坏死和炎症反应,致多组织器官功能障碍而引起感染蛙死亡。药敏特性分析显示,分离株QW08仅对氟苯尼考高度敏感,对其余19种抗生素表现出不同程度的耐药。研究结果为蛙类该病防控提供了理论依据。