甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球作为口蹄疫病毒核酸疫苗递送载体的特性评价

旨在对制备的甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly （D，L-lactide-co-glycolide），PLGA]纳米微球作为口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）核酸疫苗递送载体进行评价。采用西佛碱反应和元素分析制备具有一定取代度的甘露糖修饰的壳聚糖衍生物（mannose modified chitosan，MCS），然后，经双重乳化挥发法制备得到甘露糖修饰的壳聚糖PLGA纳米微球（MCS-PLGA-NPs）。采用纳米粒径仪检测MCS-PLGA-NPs粒径分布和表面电势（zeta）、扫描电镜考察其形态、琼脂糖凝胶电泳观察其对质粒的吸附和吸附质粒后抵抗核酸酶降解能力、CCK-8法检测MCS-PLGA-NPs的细胞毒性、激光共聚焦观察巨噬细胞对MCS-PLGA-NPs-质粒DNA复合物的摄取、荧光显微镜和Western blot验证MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA在细胞中的表达。元素分析结果表明，成功制备了取代度为5%~10%的MCS。纳米粒径测定和扫描电镜结果表明，MCS-PLGA-NPs的zeta为正值、粒径分布均匀且形态规则呈球形。琼脂糖凝胶电泳结果显示，MCS-PLGA-NPs吸附质粒的能力随着其质量的增加而增强并且可以在一定程度上抵抗核酸酶降解质粒DNA。在细胞毒性试验中，不同浓度的MCS-PLGA-NPs与RAW264.7细胞共孵育24 h后，细胞存活率仍在85%以上。在细胞摄取试验中，用激光共聚焦显微镜可以明显观察到质粒DNA结合到纳米微球表面被RAW264.7细胞摄取。荧光显微镜和Western blot试验证明MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA可以在细胞中进行表达。综上表明，本研究成功制备了MCS以及具有递送核酸疫苗能力的MCS-PLGA-NPs，为FMDV核酸疫苗的递送研究提供了新的方向和见解，也为该递送载体携带特定抗原靶向抗原递呈细胞表面甘露糖受体以及应用于动物免疫的研究奠定基础。     

保存方法对牧草DNA提取效果的影响

为从野外采集的禾本科牧草样品中获得优质DNA,在有限的试验条件下找到最合适的样品保存方法。本研究在野外试验站采集了8种禾本科牧草,分别采用变色硅胶、-20℃、4℃、自然风干和45℃烘干等5种方法进行保存,保存一个月后进行DNA的提取。通过琼脂糖凝胶电泳、ISSR-PCR以及DNA的浓度和纯度对比,对几种保存方法下保存的牧草样品中所提取DNA的效果和质量进行鉴别。此外,为了解样品中多糖和多酚含量对DNA提取效果的影响,本研究还对采集样品多糖和多酚含量与DNA浓度和纯度进行了相关性分析。结果显示变色硅胶的保存效果最佳,烘干的保存效果最差,其他3种保存方法对不同植物的保存效果不能确定。多糖和多酚含量与DNA的提取效果、提取质量无明显关系,与DNA的浓度和纯度也无显著相关性,二者不是影响本研究DNA提取效果的主要因素,本研究中DNA提取效果的差异性是由于保存方法的不同造成的。在野外试验采集禾本科牧草样品时,如需要获得优质的DNA进行深入的试验,用变色硅胶保存样品,是一种便捷、效果优越的保存方法。     

基于MeDIP-seq研究蛋氨酸对巨噬细胞炎症中甲基化水平的影响

本课题组前期已研究表明蛋氨酸(Met)能缓解脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞的炎症反应,但其调控的分子机制尚不明确。本研究旨在从甲基化角度初步探讨DNA甲基化与Met抑制LPS诱导巨噬细胞炎症中分子机制的相关性。应用全基因组甲基化测序技术(MeDIP-seq)检测空白组、LPS组和LPS+Met组细胞的全基因DNA,每组3个重复。结果表明:LPS组甲基化峰(peak)的数量、总长度和覆盖率均高于空白组和LPS+Met组;与空白组相比,LPS组的高甲基化基因数在不同基因功能元件上均多于低甲基化基因数;与LPS组相比,Met+LPS组的低甲基化基因数在不同基因功能元件上均多于高甲基化基因数。运用GO富集和KEGG分析发现,LPS组与LPS+Met组差异甲基化基因主要富集在单一生物过程(Single-Organism Process)和细胞过程(CellularProcess),信号通路主要富集在Hippo信号通路。本研究为Met调控机体免疫和炎症反应提供一定的科学依据。     

鸡脂肪组织TCF21基因启动子区DNA甲基化与其表达的关系

旨在研究鸡脂肪组织中TCF21基因启动子区DNA甲基化水平与其表达的关系。以东北农业大学高、低腹脂双向选择品系（简称高、低脂系）第24世代7周龄肉鸡为试验材料，利用RT-qPCR检测高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因的mRNA表达水平；利用生物信息学和双荧光素酶报告系统分析TCF21基因启动子的结构与功能；利用Sequenom MassARRAY飞行质谱检测高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因启动子区CpG位点的甲基化水平；利用CpG甲基转移酶处理TCF21启动子报告基因质粒，分析DNA甲基化对TCF21基因启动子活性的影响。结果显示，高脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因的mRNA表达水平极显著高于低脂系（P<0.001）；TCF21基因的启动子区存在40个CpG位点，且在启动子的近端和远端均有分布，但不存在CpG岛；将TCF21基因的启动子划分为5个功能区域，分别为R1区域（-2 000~-1 500 bp）、R2区域（-1 500~-1 000 bp）、R3区域（-1 000~-500 bp）、R4区域（-500~-200 bp）和Core区域（-200~-100 bp）；高脂系R2、R3和R2+R3区域的DNA甲基化水平显著或极显著高于低脂系（P<0.05或P<0.001）；R2、R3、R2+R3区域的DNA甲基化水平与TCF21基因mRNA表达水平呈显著正相关（R2区域：r=0.438，P<0.05；R3区域：r=0.371，P<0.05；R2+R3区域：r=0.489，P<0.05）；R2区域的DNA甲基化显著抑制其转录活性（P<0.05）。综上所述，TCF21基因在高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中的表达水平主要与其启动子R2区域的DNA甲基化水平有关。     

不同保存温度和反复冻融次数对鸭疫里默氏杆菌DNA的影响

为探究不同保存温度和反复冻融次数对鸭疫里默氏杆菌DNA的影响,研究了不同保存温度和反复冻融次数对不同浓度梯度组鸭疫里默氏杆菌DNA样品浓度及荧光定量Ct值的影响.根据OmpA基因保守序列设计了鸭疫里默氏杆菌荧光定量PCR特异性引物,产物大小为112 bp,退火温度为56℃.荧光定量循环阈值Ct值随DNA浓度的下降而升高.常温保存的DNA样品7 d后出现明显降解,保存温度为4、-20、-80℃时则对荧光定量PCR检测效率影响不大.较高浓度的A、B组DNA样品Ct值未受冻融次数的影响,而浓度较低的C、D组则在冻融21次后Ct值明显升高.研究建立了鸭疫里默氏杆菌荧光定量PCR鉴定方法,Ct值随DNA浓度的下降而升高,DNA样品应低于4℃保存,低浓度DNA应避免反复冻融.     

葡萄牙使用非洲猪瘟弱毒疫苗的历史案例分析

1957年4月非洲猪瘟(African swine fever,ASF)首次从非洲大陆传至葡萄牙里斯本,1960年4月再次传入葡萄牙并快速蔓延。因担心疫情失控及对养猪业发达地区产生影响,葡萄牙自1962年5月启动ASF疫苗田间试验。部分数据显示:接种疫苗21 d后,ASF的群体发病率为0.96%,个体发病率为1.05%;接种1个月后约有12.1%的猪出现了并发症,表现为呼吸系统、消化系统、肌肉骨骼和皮肤等方面的问题;母猪接种后部分出现流产或不孕;疫苗接种猪的肺部病变占比(21.92%)比未接种猪(4.82%)高,且不同品种猪的肺炎发病率差异较大。由于疫苗临床使用时不确定性因素较多,最终导致免疫计划终止。分析失败原因,可能是葡萄牙整体猪群健康状况较差、病毒污染面较大以及当地品种猪的易感性较高等。为科学看待ASF疫苗的使用经验和教训,本文对20世纪60年代葡萄牙的ASF"免疫失败事件"进行阐述和分析,以期为未来ASF疫苗研制提供借鉴。     

提高鸡群免疫与均匀度的关鍵技术

1鸡群免疫关键点。由于伺养规模大、养殖密度高,规模化养鸡场做好传染性疾病的预防至关重要。目前,常规疫苗免疫接种是最常用的预防方法和手段。为了使鸡群获得均匀有效的抗体,必须要做到免疫有效、准确。除了要掌握好免疫时机,还要把控好免疫剂量。笔者根据生产实践经验,简要综述了规模化养殖场的鸡群免疫关键点,希望与同行共享。     

高山马铃薯脱毒苗DNA甲基化的MSAP分析

为了解脱毒对高山马铃薯试管苗DNA甲基化水平的影响,探究DNA 甲基化在高山马铃薯脱毒后的作用,结合毛细管电泳检测技术对怀玉山高山马铃薯脱毒苗的基因组DNA甲基化进行MSAP分析。结果表明,怀玉山高山马铃薯常温继代带毒苗甲基化水平较高,经过玻璃化法超低温保存处理但未能脱毒时其甲基化水平有所下降,但甲基化仍处于较高水平,而常规茎尖培养脱毒和玻璃化法超低温疗法脱毒可明显降低试管苗的甲基化水平,且玻璃化法超低温疗法脱毒苗的甲基化水平更低。在怀玉山高山马铃薯超低温保存(未能脱毒)、茎尖常规培养脱毒和超低温疗法脱毒3个处理方式中,去甲基化模式和甲基化模式并存,但均以去甲基化模式为主要趋势,且在去甲基化模式的强弱依次为超低温疗法脱毒>茎尖常规培养脱毒>超低温保存(未脱毒)。本研究结果为怀玉山高山马铃薯脱毒苗的种质保存和规模化生产提供了一定的理论依据。