The integration and insertion site of GbVe1 gene in the genome of transgenic cotton (Gossypium hirsutum)

[Objective] The aim of this study was to obtain the flanking sequences of T-DNA in the transgenic cotton containing a GbVe1 over-expression cassette. [Method] The T-DNA insertion copy number in the transgenic GbVe1 cotton was analyzed by southern blot. Flanking sequences of the transgenic lines with putative single T-DNA insertion copy were obtained using high-efficiency Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction (hiTAIL-PCR). The T-DNA insertion sites were further confirmed by PCR with specific primers. [Result] RB-flanking sequences (119-1 018 bp) and LB-flanking sequences (243-516 bp) were obtained from three transgenic lines with low copy number of T-DNA insertion. The AT content was more than 63% in these flanking sequences. A same single insertion site in the intron of Gohir.D01G157600.1 was found in the two transgenic lines 7/100826-152 and 12/100826-393, while two separated insertion sites, one also in the intron of Gohir.-D01G157600.1 and the other in the intergenic region of A12 chromosome, were found in the transgenic line 1/w-ch14. A deletion of 21 bp was found in the insertion site in the intron of Gohir.D01G157600.1. The T-DNA insertion in the intron of Gohir.D01G157600.1 was further confirmed by the specific PCR. [Conclusion] The flanking sequences of T-DNA in the transgenic GbVe1 cotton were obtained and the specific transformation event in the intron of Gohir.D01G157600.1 was further confirmed by PCR.     

河北省玉米小斑病菌优势生理小种鉴定及ITS序列分析

2007~2016年在河北各地采集玉米小斑病标样,对分离出的356株玉米小斑病菌菌株进行生理小种鉴定。结果表明,在鉴定的年度范围内,玉米小斑病菌T小种、C小种、S生理型、O小种的分离频率在年度间存有差异,O小种的平均分离频率94.94%,是河北省玉米小斑病菌的优势小种;O小种对主栽品种郑单958和自交系C103的致病力呈下降趋势,在C103上致病力下降幅度小于郑单958。对河北省石家庄、保定、衡水、沧州邯郸、邢台采集的45株菌株进行ITS序列分析构建UPGMA进化树,分析表明,河北省内玉米小斑病菌株的遗传进化与地域有一定关系,差异不明显。     

转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

蛙皮素样肽家族及其受体氨基酸序列信息学比较分析

【目的】研究反刍动物蛙皮素样肽家族多肽及其受体的保守性。为不同动物,特别是反刍动物这2种蛙皮素样多肽及其受体蛋白抗原设计和活性多肽筛选等研究提供参考。【方法】采用生物信息分析学的方法,通过UniProt数据库比较牛的蛙皮素样肽家族胃泌素释放肽(Gastrin-releasing peptide, GRP)和神经介素B(Neuromedin B, NMB)2种多肽及其特异性受体GRP-R和NMB-R与其他动物氨基酸序列的差异性。【结果】13种动物成熟GRP多肽C-端的8个氨基酸序列完全相同,牛GRP氨基酸序列与绵羊、猪和豚鼠最高,分别为88.7%、77.8%和77.8%,与其他动物相似性低于74.1%。10种动物成熟NMB多肽C-端10个氨基酸序列完全相同。牛GRP-R与狗、马和猪等相似性最高,分别为96.1%、94.3%和94.0%,牛NMB-R与猪、人和马相似性最高,分别为92.3%、91.5%和91.0%;牛GRP-R与NMB-R相似性仅为62.2%。【结论】GRP和NMB的C-端氨基酸序列在不同动物之间均具有高度的保守性,而N-端为变化区域,且GRP-R和NMB-R氨基酸序列在动物之间保守性较高。     

林麝肺源ST1249型铜绿假单胞菌的分离鉴定及其全基因组序列分析

【目的】对分离自林麝化脓肺脏的1株疑似铜绿假单胞菌(PA)进行鉴定,并分析其致病和耐药机制,为林麝PA感染化脓性疾病的防控奠定基础。【方法】将病原菌分离纯化后,依次进行生化试验、16S rRNA序列分析、药敏试验和小鼠致病性试验,并通过全基因组测序,对分离菌株进行群体进化和物种分型分析以及基因功能注释。【结果】分离自林麝化脓肺脏的1株疑似铜绿假单胞菌经鉴定与PA相符,命名为FMDP001。药敏试验显示其对阿莫西林、头孢曲松、氨曲南、多粘菌素B和林可霉素耐药;对小鼠半数致死量为9.4×10~5 CFU/mL。全基因组序列分析显示该菌基因组大小为6 955 100 bp,序列类型为ST1249,与B136-33株同源性最高,且两菌株基因组平均核苷酸一致性(ANI)值达98.93%;全基因组中共有357个序列编码FMDP001与致病性相关的基因,根据功能分为黏附、铁摄取、胞外毒性蛋白和调控系统;84个序列编码耐药基因,其中多药耐药外排泵为主要成分。【结论】从林麝化脓肺脏中分离到1株致病性较强的PA,并获得ST1249型林麝源PA的全基因组序列,序列显示该菌携带大量药物外排泵及生物膜形成相关基因,决定其具有多重耐药特性,哌拉西林等可作为该类型PA感染的临床用药。     

云南和广东省流行性出血病病毒血清6型毒株(EHDV-6)的分离与遗传特性

【目的】分离流行于我国南方地区的流行性出血病病毒血清6型毒株(EHDV-6),掌握分离毒株的遗传特征。【方法】对设立于我国云南和广东省的哨兵动物定期采血,进行EHDV感染情况监测与病毒分离培养。通过血清中和试验确定分离EHDV的血清型,采用一步法RT-PCR对分离的EHDV-6毒株基因节段2、3、6(Seg-2、-3、-6)进行扩增与序列分析。【结果】2012—2016年,从云南省和广东省的哨兵动物中分离出25株EHDV毒株,其中,11株为EHDV-6型。中国EHDV-6型毒株的Seg-2、-3与-6均属Eastern型,核酸序列相似性分别为99.1%、98.9%和98.8%,在系统发生树上分别聚为1个独立的中国支系。在日本引起疫病暴发的EHDV-6型毒株与中国EHDV-6型毒株具有最近的亲缘关系。日本EHDV-6型毒株在系统发生树上处于中国支系内部,Seg-2、Seg-3与中国毒株的核酸序列相似性分别为98.5%和93.9%。【结论】云南和广东省流行的EHDV-6型毒株核酸与氨基酸序列高度相似;日本和中国的EHDV-6型毒株具有最近的亲缘关系,提示中日之间可能存在EHDV的流动。研究结果为进一步开展我国EHDV-6型毒株流行病学分析、致病性、病原学诊断与疫苗制备等研究提供了基础。     

加州鲈弹状病毒三水株全基因组序列测定及分析

【目的】对加州鲈弹状病毒弱毒三水株(MSRV-SS-7)及其母源株(MSRV-SS)进行全基因组克隆和测序分析。【方法】采用分段扩增方法对MSRV-SS-7及MSRV-SS基因组核心序列进行PCR扩增,第1轮根据鳜鱼弹状病毒(SCRV)基因序列(NC_008514.1)设计10对引物进行扩增并测序;在第1轮扩增产物测序、拼接基础上,设计8对引物进行第2轮扩增,拼接后获得基因组核心序列。同时用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得3′和5′末端序列。采用Vector NTI 8.0对基因组核心序列和末端序列进行拼接,获得基因组全序列,使用Clone Manager 8.0对MSRV-SS-7和MSRV-SS进行序列比对分析;同时使用DNAMAN将基因组G基因序列转换为氨基酸序列,并通过MEGA 5.0与其他鱼类弹状病毒的G蛋白氨基酸序列进行进化树分析。【结果】MSRV-SS-7及其母源株MSRV-SS基因组全长均为11 548 bp,包含N、P、M、G、L等5个结构基因,基因组结构为3′Leader-N-P-M-G-L-Trailer 5′;MSRV-SS-7与MSRV-SS全基因组中共有10处核苷酸不同。G蛋白进化分析表明,MSRV-SS-7及母源株MSRV-SS与SCRV亲缘关系最近,且与鲈鱼弹状病毒属(Perhabdovirus)聚为一支。【结论】克隆分析了MSRV-SS-7的全基因组序列,可以用于后续活疫苗的开发。     

不同年代大丽轮枝菌菌株的生物学特性和ISSR分析

 为了探究不同年代的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)菌株生物学特性和遗传多样性方面的差异,本文以我国黄河流域和长江流域主产棉区6个省的不同年代大丽轮枝菌菌株为研究对象,观察培养性状,测定致病类型(致病力、落叶型),同时采用ISSR指纹图谱分析其遗传多样性。结果显示,不同年代大丽轮枝菌之间菌丝生长速率无显著差异,但菌核型菌株所占比例有减少趋势;2007~2009年和2017年的菌株全部为落叶型菌株,而1983~2000年的菌株中落叶型菌株仅占28.6%,表明随着年代的推移,黄河流域和长江流域的落叶型菌株所占比例呈上升趋势;不同年代菌株之间致病力存在显著差异,1983~2000年、2007~2009年和2017年的菌株中强致病力类型菌株分别占21.4%、25.0%和38.9%,仅有的5株弱致病力类型菌株均为1983~2000年的菌株;与2000年后的菌株相比,1983~2000年的菌株,Nei′s基因多样性指数为0.205 1,Shannon信息指数为0.299 0,表现出更丰富的多样性,利用NTSYS软件和Structure软件对ISSR指纹图谱进行聚类分析,两种方法均将所有供试菌株分为4个类群,且聚类结果与致病力和不同年代之间均具有一定的相关性,与地理来源无明显相关性。本研究结果表明,过去30年间我国黄河流域和长江流域棉田黄萎病菌落叶型和强致病力类型菌株所占比例逐渐升高,且不同年代和不同致病力的菌株在遗传上有差异,为进一步探究大丽轮枝菌的遗传与进化奠定了基础。     

大花君子兰叶绿体基因组及其特征

采用Illumina MiSeq测序平台对大花君子兰（Clivia miniata）叶片总DNA进行测序，通过组装获得了其叶绿体基因组（cpDNA）全长序列（158 114 bp）。对其cpDNA注释得到135个基因，包含87个蛋白编码基因、40个tRNA基因和8个rRNA基因。采用生物信息学方法对获得的cpDNA进行简单序列重复（SSR）分析和密码子偏好性分析。结果显示：①大花君子兰cpDNA中共有61个SSR位点，其中单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复数分别为38、9、2、8、3和1个，多数SSR分布在基因间隔区；②大花君子兰cpDNA密码子偏爱以A或U（T）结尾，亮氨酸使用频率最高，半胱氨酸使用频率最低。基于24种植物的cpDNA全长和23种植物的叶绿体ycf2基因序列进行系统发育分析，结果显示大花君子兰与石蒜科植物在同一分支，显示最近的亲缘关系，支持大花君子兰属于石蒜科。基于叶绿体ycf2的系统发育分析结果与基于cpDNA全长的系统发育分析研究结果大部分相同，支持ycf2基因可以代替cpDNA全长用于植物系统发育分析。