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1.
鲤疱疹病毒2型武汉株的分离与鉴定   总被引:8,自引:2,他引:6       下载免费PDF全文

采用细胞培养、超薄切片电镜观察、巢式PCR检测以及病毒DNA克隆与测序分析等技术, 从湖北武汉一循环水养殖系统中患出血病异育银鲫(Carassius auratusgibelio)体内分离鉴定了一株鲤疱疹病毒2(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)病毒, 命名为鲤疱疹病毒2型武汉株(CyHV-2-WH)。患病鱼组织匀浆液接种锦鲤鳍条细胞系(Koi-Fin)可产生典型的细胞病变效应。用患病鱼组织匀浆液与细胞培养物分别人工感染异育银鲫, 均可重复出与自然发病相同的症状, 死亡率达100%。患病鱼脾与肾脏组织超薄切片电镜观察结果显示, 病毒为具囊膜的球形病毒, 囊膜直径为170~200 nm, 病毒衣壳直径为110~120 nm, 病毒在细胞核内复制、组装。采用CyHV-2的特异引物对病鱼样本和感染细胞培养物样本进行巢式PCR检测, 均能扩增出357 bp的目的条带, 将该扩增产物进行测序与比对分析后发现, 其与GenBank中已报道的CyHV-2毒株的DNA解旋酶基因高度同源(99.44%以上), 与鲤疱疹病毒3(CyHV-3)也有较高的同源性(81.55%)。系统进化分析结果显示, CyHV-2-WH株与JS2012H.FukudaYC110907CyHV-2病毒株属同一分支。

  相似文献
2.
为了查明鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的理化与生物学特性以及病毒在细胞内的超微形态发生过程,利用新建立的对CyHV-2敏感的异育银鲫脑组织细胞系(GiCB),对CyHV-2的理化及生物学特性进行了详细研究,比较了不同来源鱼类细胞系对CyHV-2感染的敏感性,并对体外培养细胞中CyHV-2病毒粒子及其超微形态发生过程进行了电镜观察.结果显示,CyHV-2对热、酸、碱、有机溶剂和冻融敏感;常用鱼类细胞系EPC、RTG-2、Koi-Fin、CIK、CCK、PF-Fin对CyHV-2的感染不敏感,特异性巢式PCR检测盲传至第7代CyHV-2细胞培养物,结果均为阴性;CyHV-2在GiCB细胞中的增殖动态研究结果表明:病毒感染细胞经过12h的隐晦期,24 h开始进入对数生长期,96 h病毒滴度达到最高值(107.520.26 TCIDso/mL),然后进入平台期;透射电子显微镜观察结果显示,CyHV-2感染细胞可分为吸附与侵入、复制与装配、成熟与释放3个主要过程,病毒进入对数生长期后,被感染细胞内可见形态典型的疱疹病毒颗粒.  相似文献
3.
Morphogenesis of koi herpesvirus observed by electron microscopy   总被引:2,自引:0,他引:2  
Koi herpesvirus (KHV or cyprinid herpesvirus 3) was inoculated onto three fish cell lines derived from carp, Cyprinus carpio L., and the process of virion formation observed with electron microscopy. Essentially, similar features of virus particles were observed in all three cell lines. The nucleus of infected cells was characterized by margination of chromatin and often contained many capsids of about 110 nm in diameter with varying morphology. The morphological variation of the capsids was very similar to that of mammalian herpesviruses. Some capsids protruded from the inner nuclear membrane, and others, with envelopes, were located in the perinuclear space between the inner and outer nuclear membrane, suggesting budding of capsids at the inner nuclear membrane. Naked capsids and envelopment of capsids by budding into vesicles were also observed in the cytoplasm. Mature, enveloped virions 170-200 nm in diameter were seen in cytoplasmic vesicles or outside the cell. These observations suggest KHV virions mature through a complex morphological pathway including two distinct envelopments, which have been found only in herpesviruses. These observations support the inclusion of KHV in the family Herpesviridae.  相似文献
4.
混养的异育银鲫和鲢鱼种大批死亡,为明确发病死亡的病原和组织损伤并提供相关的疾病防控措施,进行了病鱼肉眼和显微镜检查、细菌学检测、病毒学检测、组织病理和药敏试验研究.结果发现,除在患病鱼体表偶然发现有少量不会引起充血等症状的杯体虫和车轮虫外,未在体内外发现其他寄生虫和真菌类病原;通过细菌分离、人工回感试验、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,从患病异育银鲫和鲢分离到的致病菌株均为嗜水气单胞菌;根据异育银鲫和鲢病毒性疾病的现状,使用鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA聚合酶基因的特异性引物分别对自然发病的异育银鲫和鲢进行PCR检测,只有异育银鲫检测到CyHV-2,分别用它们的除菌组织上清液进行人工感染试验,只有异育银鲫出现充血症状和死亡现象;由此得出嗜水气单胞菌是异育银鲫和鲢发病死亡的主要病原,CyHV-2是异育银鲫混合感染的次要病原.患病鲢与患病异育银鲫呈现出类似的组织病理现象,又有一些各自特有的组织病理表现,单纯细菌感染的鲢轻度病变以细胞颗粒变性为主,坏死细胞以核溶解为主,细菌和病毒混合感染的异育银鲫肝脏轻度病变以细胞滴状玻璃样变的变性为主,坏死组织细胞以核固缩和核碎裂为主,在肾脏和脾脏出现染色质边集于核膜的肿大细胞核,主要组织器官出现从变性到坏死的病理变化过程,最终失去应有的功能而死亡.依据药敏试验结果,建议内服诺氟沙星和氟苯尼考等抗生素防治本病的嗜水气单胞菌感染,混合感染CyHV-2的异育银鲫可以通过注射CyHV-2疫苗和生态养殖的方法控制和减少该病毒病感染和发展.  相似文献
5.
分别采用腹腔注射含鲤疱疹病毒Ⅱ型( Cyprinid herpesvirusⅡ, CyHV-2)的组织浆和患病鱼直接感染的方法进行人工感染实验,并对实验鱼发病组织病毒DNA进行巢式PCR检测,将扩增产物进行测序比对,研究聚六亚甲基胍( Polyhexamethylene guanide, PHMG)对异育银鲫( Carassius auratus gibelio)感染鲫造血器官坏死症( Crucian Carp Hematopoietic Necrosis)的防治效果。结果显示:两种人工感染的方法出现相似的感染症状,但后者感染周期相对较短;实验毒株与GenBank中已报道的CyHV-2毒株的DNA解旋酶基因具有高度同源性(99.0%),该毒株与JSSY、 YC110907等CyHV-2其他病毒株属同一分支。药物预防实验表明:当PHMG浓度≥0.5 mL/m3时,保护率可达60%以上,对该病有显著抑制作用。治疗实验表明,药物对感染3 d后的鲫具有显著抑制作用,当PHMG浓度≥0.75 mL/m3时,保护率达63.33%以上,对该病有较好的治疗效果;当PHMG浓度≥2.5 mL/m3时,对感染5 d后的鲫具有显著抑制作用,保护率达63.33%以上。低浓度的药物治疗效果虽不显著,但可延长病鱼的存活时间。  相似文献
6.
根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus II,CyHV-2)ORF 4基因序列(GenBank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1041 bp,将其克隆至原核表达载体pET-32a (+)中,构建了重组原核表达载体pET-32a-ORF 4。将pET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致。将纯化的重组蛋白免疫日本大耳兔,制备了多克隆抗体, ELISA检测抗体效价大于1∶50000, Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接免疫荧光检测结果表明:该多克隆抗体可与由CyHV-2感染引起细胞病变的异育银鲫脑组织细胞( GICB)发生特异性的结合。  相似文献
7.
通过PCR检测及序列对比分析,确诊江苏海丰农场两塘口内异育银鲫(Carassius auratus gibelio)所患疾病为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ,CyHV-2)引发的鲫造血器官坏死症(Crucian Carp Hematopoietic Necrosis),而后分别每10 d使用0.5 mL/m3和0.75 mL/m3聚六亚甲基胍(Polyhexamethylene guanide,PHMG)泼洒治疗,并定期采样,利用Real Time PCR测定样品中病毒表达量.结果显示:该病毒(DF2015)CyHV-2的DNA解旋酶基因序列长为316 bp,与绝大多数病毒株有较近的亲缘关系(99%),但与病毒株ST-J1和H.Fukuda的亲缘关系相对较远(63%).与其余病毒株等有较近的亲缘关系(99%);治疗近2个月后,两塘的病毒相对表达量均呈下降趋势,且具有显著差异性(P<0.05),但0.75 mL/m3治疗塘病毒相对表达量极显著降低(P<0.01),治疗效果相对更显著.  相似文献
8.
2015-2016年对来自黑龙江地区46个养殖场送检的鲤鱼进行锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)的分离鉴定,并应用DNAStar等软件对检出的阳性样本的主要囊膜蛋白(Major envelop protein,MEP)基因进行生物信息学分析.结果显示,KHV的检出率约为6.5%,3株阳性样本具有相同的MEP基因序列,称之为KHV-HLJ1516.MEP基因开放阅读框为771 bp,编码256个氨基酸,相对分子质量为28 280.58,等电点为8.40.对KHV-HLJ1516的MEP基因序列同源性分析表明,其与KHV-GZ11分离株仅有1个碱基不同,但并未导致氨基酸发生改变,碱基相似性为99%;而与HZ419分离株相比,KHV-HLJ1516的MEP基因有3个碱基发生突变,相应的氨基酸由Asn变为IIe.聚类分析结果显示,KHV-HLJ1516与KHV-GZ11处于同一分支,而HZ419位于另一分支.B细胞抗原表位预测结果显示,KHV-HLJ1516的MEP的抗原表位主要位于4~11,24~40,42~63,82~110,209~218,238~249氨基酸区段.  相似文献
9.
为分析患鲫造血器官坏死症异育银鲫Carassius auratus gibelio体内不同器官组织中鲤疱疹病毒(CyHV-2)粒子的形态结构、分布和发生过程,采集患病异育银鲫体肾、脾脏、头肾、肝胰脏、肠道、鳃各组织样本,利用透射电镜观察疱疹病毒和组织细胞超微病理学.在所采集器官组织中均观察到鲤疱疹病毒Ⅱ型的DNA内核、空衣壳、实心核衣壳、含包膜成熟病毒共4种不同成熟时期的病毒粒子,不同时期的病毒粒子直径分别为65 ~90nm、90~180nm、90~180nm、170~220nm;体肾和脾脏中含有大量的CyHV-2病毒,而头肾、肝胰脏、肠道和鳃中病毒粒子较少;CyHV-2病毒主要感染体肾、头肾、脾脏的吞噬细胞,导致机体免疫机能改变;组织细胞病理学观察发现吞噬细胞核边缘化,核内染色质变性,核膜溶解,线粒体嵴断裂,出现空泡,个别细胞溶解坏死.通过PCR检测和电镜观察病毒粒子结构特征,确诊异育银鲫感染CyHV-2病毒,主要器官组织细胞中均有CyHV-2病毒,且在细胞核中完成复制和组装,在细胞质中获得外膜.感染CyHV-2病毒的异育银鲫主要器官组织均受到一定的损伤.  相似文献
10.
于江苏大丰金鹿合作社采集三种状态的异育银鲫Carassius auratus gibelio样本,试验1组(H)来自未发生过鲤疱疹病毒(CyHV-2)病的2个池塘(面积200×667m2),即为无CyHV-2病症状的病毒携带者;试验2组(IH)和试验3组(Ⅰ)为正在发病的2个池塘(面积200×667m2),IH组有轻微的CyHV-2病症状,而Ⅰ组为典型的CyHV-2病症状,测定其血成分、血清生化指标,并观察肠道和肝胰脏的组织病理学,以探讨异育银鲫感染鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)的发病机制.结果表明:IH组和Ⅰ组鲫除淋巴细胞百分比显著升高外(P<0.05),中性粒细胞和单核细胞百分比、红细胞和血栓细胞数、血红蛋白、血栓细胞压积均显著低于H组(P<0.05);Ⅰ组淋巴细胞百分比显著高于IH组(P<0.05),而中性粒细胞百分比却显著低于IH组(P<0.05),其他各项指标无显著差异.IH组和Ⅰ组除天门冬氨酸基转移酶/丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、白球比例比H组显著升高外(P<0.05),胆碱酯酶和碱性磷酸酶活性、总胆汁酸、甘油三酯、高密度脂蛋白/低密度脂蛋白均显著下降(P<0.05).Ⅰ组与IH组结果比较,天门冬氨酸基转移酶、天门冬氨酸基转移酶/丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、白球比例均出现显著升高(P<0.05),而胆碱酯酶、碱性磷酸酶出现显著下降(P<0.05),总胆汁酸含量下降了38倍,下降明显,其他均无显著变化.扫描电镜观察发现,H组红细胞表面光滑完整,IH和Ⅰ组均有一定的损伤;相比H组,IH组、Ⅰ组的肝胰脏和肠道的组织结构损伤,且随着患病严重性的增加而加重.  相似文献
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