大鲵虹彩病毒贵州分离株MCP基因的克隆与原核表达

根据Gen Bank中大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白MCP(major capsid protein,MCP)基因序列(序列号:KF512820),设计一对特异性引物,以大鲵虹彩病毒贵州分离株基因组DNA为模板,PCR扩增大鲵虹彩病毒MCP基因并测序,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因进行比对,然后将其亚克隆到原核表达载体p ET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后进行Western blot分析。结果显示:PCR扩增出长度为1 392 bp的片段,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因核苷酸序列相似性为99.7%~99.9%,SDSPAGE电泳显示该重组蛋白的相对分子质量约为67×103。免疫原性检测结果表明,该重组蛋白可与兔抗大鲵虹彩病毒阳性血清特异性反应,具有免疫原性。     

十足目虹彩病毒(DIV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

本研究以十足目虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1, DIV1)主要衣壳蛋白基因为靶序列设计引物，建立了DIV1的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测方法，并以pMD18-DIV1质粒标准品为模板对该方法的检测灵敏度、检测特异性等进行了评估。结果显示，此方法最适反应温度为64.4℃，优化后的25 μl反应体系中包含2.5 μl 10×Isothermal amplification buffer、4.0 mmol/L Mg2+、1.2 mmol/L dNTPs、6.4 U Bst 2.0 WarmStart® DNA聚合酶、0.8 μmol/L EvaGreen®和4.4 μl ddH2O。该方法检测灵敏度下限为3.54×102拷贝/反应；与虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、对虾偷死野田村病毒(CMNV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)和黄头病毒(YHV)等主要虾类病原没有交叉反应；具有较好的重复性和稳定性。以GeneFinder®替换EvaGreen®并将其预置于反应管内，结合上述扩增方法可实现对DIV1的现场快速高灵敏检测。本研究建立的DIV1-LAMP实时荧光定量和现场检测方法具有灵敏、特异和快速等特点，为近几年新发虾类病原DIV1的定性、定量以及现场快速检测提供了新的技术选择，有利于对虾养殖业中开展DIV1的监测、预警和防控。     

真鲷虹彩病毒自然感染杂交石斑鱼“褐龙斑”的组织病理分析

褐龙斑是雌性褐石斑鱼(Epinephelus bruneus)和雄性鞍带石斑鱼(E. lanceolatus)杂交产生的子代。作为杂交石斑鱼的新品种，国内外尚没有褐龙斑疾病的报道。2017年7月，某养殖场褐龙斑出现急性死亡，10 d内累积死亡率高达80%。现场调查发现，病鱼外观无明显异常，但反应迟钝，伏底死亡。临床检查和剖检可见脾和肾严重肿大、易碎。组织病理切片观察发现，各组织中存在数量不等的嗜碱性、细胞质均一、直径为10~15 µm的肿大细胞。超薄组织切片中发现，肿大细胞胞质内存在大量直径为130~150 nm的虹彩病毒样颗粒。使用特异性的PCR引物，从病鱼脾、头肾等组织中均检测到真鲷虹彩病毒(Red seabream iridovirus, RSIV)的高强度感染。测定了该病毒主要衣壳蛋白(Major capsid protein, MCP)基因1362 bp的全长编码区，构建了19种(株)虹彩病毒系统发育树，结果显示，该病毒属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属RSIV类群。本研究首次描述了褐龙斑虹彩病毒病的组织病理特征，揭示了褐龙斑是RSIV新的敏感宿主，为杂交石斑鱼病毒病的诊断与防治提供了重要的参考依据。     

不同氨基酸组合对真鲷(Chrysophrys major)诱食效果的研究

试验以真鲷为试验对象,采用迷宫法,以丙氨酸、甘氨酸、精氨酸和组氨酸作为诱食剂原料,经不同组合后测定其对真鲷的诱食效果。结果显示,甘氨酸+组氨酸的诱食效果最好,其各种组合的诱食效果依次为甘氨酸+组氨酸>甘氨酸+丙氨酸>甘氨酸>组氨酸>丙氨酸>丙氨酸+精氨酸>丙氨酸+甘氨酸+组氨酸>精氨酸+组氨酸>甘氨酸+精氨酸>甘氨酸+丙氨酸+精氨酸>丙氨酸+组氨酸>精氨酸>丙氨酸+精氨酸+组氨酸>甘氨酸+丙氨酸+精氨酸+组氨酸。     

一种真鲷球形病毒的形态及细胞病理学电子显微镜观察

对１９９５年青岛地区患病真鲷肝脏、肠上皮组织、贤脏、鳃等组织进行电镜观察，发现一种球形病毒，该病毒具有囊腊，直径为８０￣１００ｎｍ，在核和细胞质中均形成不规则形态包涵体；细胞病理变化表现为核内染色质变性，核膜水肿变形且部分溶解，内质网膨胀，胞质内有大量游离核糖体分布，线粒体外膜及内嵴变形且有少量溶解。     

水生动物虹彩病毒的分子生物学及研究进展

在水生动物病毒病害中，虹彩病毒引起的系统性疾病占有很重要的地位，而且虹彩病毒能感染鱼类、两栖类及爬行类动物，给全世界水产业带来了重大经济损失。本文拟就虹彩病毒各方面的特性作一叙述。     

真鲷胃肠道产蛋白酶菌株的分离与筛选

利用酪蛋白培养基和脱脂乳培养基,从健康真鲷肠道中筛选产蛋白酶菌株,并利用福林-酚试剂法测定其酶活力.通过形态学和生理生化手段对产酶能力较强的菌株进行初步鉴定.从健康真鲷肠道中共筛选出20株产蛋白酶菌株,占真鲷肠道茵群的17.4%;其中H1-16、D1-7、X1-5和X2-3产酶活力特别强,所测酶活力分别为45.45、54.55、63.65和59.1 U/mL.为今后制成益生茵制品应用于水产养殖,提高养殖动物的存活率和生长速度提供了理论基础.     

摄食水平和饵料种类对3种海洋鱼类生长和生长效率的影响

采用室内流水模拟法测定了摄食水平与铒料生物种类对真鲷、黑鲷、黑Ｊｕｅ特定生长率和生长效率的影响。３种实验鱼类的物壹生长率均随摄食水平增大呈减速增长趋势。二者间的定量关系和对数曲线描述；而其生长效率则均随摄食水平增大呈倒“Ｕ”形变化趋势。二者间的定量关系可用二次曲线描述，曲线相关检验结果表明，其特定生长率和生长效率与摄食水平之间均呈显著相关关系。依据上述定量关系，分别求得３种鱼的维持摄食量和最佳摄食     

真鲷与黑鲷杂交繁育技术研究

通过对真鲷黑鲷杂交繁育，培育出一种能结合父母本性状，具有生长速度快、抗逆性强的杂交子一代。2006年3月从海区选购真鲷（Pagrosomusmajor）、黑鲷（Spraus macrocephalus）亲鱼，通过强化培育，性腺促熟，于4月进行干法人工授精。通过对真鲷♀×黑鲷8及黑鲷♀×真鲷♂获得杂交受精卵，结果真鲷♀×黑鲷♂受精率为87．4％，孵化率为85％，出苗率14．28％；黑鲷♀×真鲷♂受精率为92．1％，孵化率为90％，出苗率7．2％，该批次共获得正交反交杂交鱼苗32000尾。从杂交实际结果看，不管正交还是反交都比自交的结果差，说明它们之间存在生殖隔离，杂交繁育难度相当大，要达到规模生产。需要继续研究、试验。     

大口黑鲈病毒性溃疡病病原的分离和鉴定

对广东省佛山地区2008年夏季高温时期暴发的大口黑鲈溃疡病的病原进行分离，从患病鱼的病灶肌肉组织中分离到5株嗜水气单胞菌,人工感染健康大口黑鲈，均未出现溃疡暴发病的典型症状病鱼体表大片溃烂，裸露肌肉坏死并有出血，尾鳍、胸鳍和背鳍基部红肿溃烂。制备病灶肌肉组织的除菌过滤液，背部肌肉注射感染健康大口黑鲈，7 d后出现典型的溃疡病症状。取自然发病鱼和人工感染的患病鱼病灶肌肉组织制作超薄切片，经电镜观察，均发现组织中有大量病毒颗粒，病毒粒子有囊膜，呈六角形，为正20面体对称结构，大小约为145.5 nm。根据已知虹彩病毒主要衣壳蛋白（MCP）基因序列设计特异引物，提取人工感染发病鱼病灶肌肉组织的DNA进行PCR扩增，将扩增片段进行序列测定与分析，结果表明该序列与已报道的虹彩病毒MCP基因有着较高同源性（39.5％～100％）。从电镜观察和MCP基因测序分析结果确认该病毒为虹彩病毒科蛙病毒属中的一种病毒，与国外报道的大口黑鲈病毒（LMBV）在分子特性和引起的疾病特征上有一定差异。研究结果表明引起大口黑鲈溃疡性暴发病的病原是虹彩病毒，将该病暂命名为大口黑鲈病毒性溃疡病。