犬淋巴细胞的体外活化及增殖研究

为探讨犬淋巴细胞的分离、激活和增殖以进一步研究犬肿瘤的过继免疫疗法,用Ficoll密度梯度离心液对犬的全血进行分离,得到淋巴细胞。克隆犬CD86基因并构建了人工抗原递呈细胞K562.CD32.GFP-cCD86稳定细胞系。分别通过刀豆蛋白(ConA),抗CD28抗体,或者结合CD3抗体的K562.CD32.GFP-cCD86细胞激活犬淋巴细胞,通过Coulter Counter对T细胞进行计数和体积分析,并在显微镜下观察细胞激活后的形态变化。结果显示,在体外成功分离到犬外周血淋巴细胞。在不同扩增条件下,K562.CD32.GFP-cCD86结合抗CD28和CD3抗体对淋巴细胞有最好的激活效果和增殖效率,在激活第8天细胞可以达到44倍的增殖。研究结果为犬淋巴细胞的体外分离和增殖提供了有效方法,并为犬的肿瘤免疫治疗研究奠定了基础。     

体外棕榈酸诱导自噬调节奶牛淋巴细胞炎症通路

为探讨体外棕榈酸(Palmitic acid,PA)是否可以通过自噬调节奶牛淋巴细胞炎症信号通路的激活,分离健康奶牛淋巴细胞,采用3-MA(3-Methyladenin,细胞自噬抑制剂)和不同质量浓度PA作用于淋巴细胞,收集细胞及上清,利用qRT-PCR检测淋巴细胞LC3B、Beclin1、mTOR、UKL1、SQSTM1、IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达情况;利用CCK-8和酶联免疫吸附法分别测定细胞活性和促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放量。CCK-8结果表明:PA显著抑制淋巴细胞活性(P0.01),添加自噬抑制剂3-MA后细胞活性显著增强(P0.01);qRT-PCR结果表明:与对照组(PA=0μg/mL)相比,PA处理组(不含3-MA)ULK1和LC3B mRNA表达极显著增加(P0.01),mTOR、Beclin1和SQSTM1 mRNA表达极显著降低(P0.01);IL-1β和IL-6 mRNA表达显著增强(P0.01),而TNF-α未表达;添加3-MA后,与1μg/mL PA处理组相比较,SQSTM1和Beclin1极显著增加,而LC3B mRNA表达极显著降低(P0.01);IL-1β和IL-6 mRNA表达显著下调(P0.01);PA增加促炎因子IL-6和IL-1β的释放(P0.01),显著抑制TNF-α释放(P0.01),而含有3-MA的PA混合处理组则显著降低(P0.01)。综上,PA可通过自噬调节奶牛淋巴细胞炎症信号通路的激活。     

饲粮维生素E缺乏对雏鸡生长性能及脾脏淋巴细胞凋亡的影响

试验旨在研究饲粮中维生素E缺乏对雏鸡生长性能、脾脏组织和脾脏淋巴细胞形态结构、脾脏淋巴细胞凋亡相关蛋白和基因表达水平的影响。选取1日龄雄性雏鸡160羽,随机分为2组,饲粮维生素E缺乏试验组的预混料中不添加维生素E,对照组额外添加维生素E(30 mg/kg),每组各80羽,每组10个重复,每个重复8羽,试验期40 d。结果表明：试验组雏鸡平均日增重低于对照组（P<0.05）,耗料增重比高于对照组（P<0.05）;试验组雏鸡脾脏组织和脾脏淋巴细胞中维生素E含量低于对照组（P<0.05）;试验组雏鸡脾脏组织和脾脏淋巴细胞结构出现损伤;试验组雏鸡脾脏淋巴细胞中Caspase-3活性高于对照组（P<0.05）;试验组雏鸡脾脏淋巴细胞中Bcl-2的mRNA表达量低于对照组（P<0.05）,p53和Caspase-3的mRNA相对表达量高于对照组（P<0.05）。由此可见,饲粮中维生素E缺乏将导致雏鸡生长性能显著降低;维生素E缺乏通过提高脾脏淋巴细胞中Caspase-3活性,影响Bcl-2、p53和Caspase-3基因表达诱导脾脏淋巴细胞凋亡。     

稳定表达山羊SLAM受体的BHK-21细胞系的建立及应用

信号淋巴激活分子(SLAM)又称为CD150,是小反刍兽疫病毒(PPRV)和犬瘟热病毒(CDV)等麻疹病毒属病毒感染淋巴细胞的主要受体,在病毒侵入细胞中发挥重要作用。为建立稳定表达山羊SLAM(g SLAM)的真核细胞系,本研究将人工合成的g SLAM基因克隆至真核表达质粒p IRESpuro3中,并在该基因的3'端引入Flag标签序列作为分子标记,构建了重组质粒p IRES3-g SLAM。将该重组质粒转染BHK-21细胞,经嘌呤霉素加压筛选及采用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组PPRV病毒(r PPRV/GFP)感染鉴定后,筛选到稳定表达g SLAM基因的细胞系。r PPRV/GFP感染和western blot鉴定表明,无论是否有嘌呤霉素压力的存在,该细胞系在传代至第20代,仍能稳定表达g SLAM蛋白。由于g SLAM氨基酸序列与犬的同源性较高,以表达GFP重组CDV强毒株(r CDV/GFP)感染该细胞系,病毒可以感染且能形成明显的细胞病变,表明该细胞系可用于CDV强毒分离和致弱机制等相关研究。     

禽呼肠病毒感染对SPF鸡外周血T细胞亚型变化和细胞因子转录的影响

为探讨禽呼肠病毒(ARV)对SPF鸡外周血淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞数量变化和细胞因子mRNA转录水平的影响,利用流式细胞术和实时荧光定量PCR方法分别测定了ARV感染后1、7、14、21、28、35d感染组和对照组SPF鸡外周血淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞含量和细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α基因mRNA相对转录时相。流式细胞术检测结果表明,SPF鸡感染ARV后7d和14dCD4+、CD8+T细胞比值高于对照组,其中感染7d,CD8+T细胞含量差异显著(P0.05);感染后1、21、28、35d感染组CD4+、CD8+T细胞比值均低于对照组,感染1d后CD4+、CD8+T细胞含量均差异显著(P0.05),说明外周血T细胞亚型变化是ARV感染的重要表现之一。实时荧光定量PCR结果表明,与对照组相比,感染组外周血淋巴细胞中IL-1β、IL-6(除7d外)、IL-18(除14d外)和TNF-α在整个感染过程中表达上调,IL-17和IFN-γ除感染1d外,均表达下调,说明IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-α均参与了ARV的感染进程。     

高钼对小尾寒羊外周血T淋巴细胞和免疫球蛋白的影响

为研究高钼对小尾寒羊细胞免疫和体液免疫功能的影响,12只2月龄小尾寒羊为试验材料,随机分为3组,分别喂以基础日粮120d,对照组(Mo 5.61mg/kg)、高钼日粮Ⅰ组(Mo 30mg/kg)、高钼Ⅱ组Mo 60mg/kg)。采用α-醋酸萘酯酶法、流式细胞术和酶联免疫吸附试验分别观察外周血T淋巴细胞和免疫球蛋白的变化。α-醋酸萘酯酶法和流式细胞术的检测结果表明:整个试验期间,加钼组小尾寒羊外周血T淋巴细胞ANAE阳性率、CD4+和CD8+T淋巴细胞及CD4+/CD8+的比值与对照组相比显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)。酶联免疫吸附试验结果表明,与对照组相比加钼组小尾寒羊血清免疫球蛋白IgE的含量无显著变化(P>0.05),免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的含量与对照组相比呈不同程度的降低,且存在剂量-效应关系。结论,高钼(≥30mg/kg)能够对小尾寒羊外周血T淋巴细胞造成损伤,导致机体免疫球蛋白含量的降低,影响机体细胞免疫和体液免疫。     

PRRSV特异性肽对CSFV、PRRSV疫苗免疫猪后T淋巴细胞亚群的影响

用猪瘟疫苗和高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗对猪进行免疫,在免疫后的14d和28d采集外周血液,分析特异性抗体表达量和外周血T淋巴细胞表型的变化,并用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)特异性肽对淋巴细胞进行刺激。结果显示,在PRRSV免疫后14d,机体PRRSV抗体水平较低,其中CSFV低抗组中CD4+细胞百分数明显降低,CD4+/CD8+细胞的比值也明显降低;用PRRSV特异性肽刺激淋巴细胞24h后,CSFV低抗组与高抗组中CD3+、CD8+细胞的百分数都明显升高,CD4+细胞的百分数及CD4+/CD8+细胞的比值都明显降低。在PRRSV免疫后28d,CSFV抗体和PRRSV抗体的产生都比较高,CD3+细胞、CD4+T淋巴细胞百分数及CD4+/CD8+细胞的比值也明显升高,用肽刺激以后,CSFV高抗组中的CD3+细胞百分数降低,CSFV低抗组中的细胞百分数升高,CD4+/CD8+细胞的比值在所有组中均下降。结果表明,PRRSV特异性肽在PRRSV免疫早期可以使CD3+细胞的百分数升高,CD4+/CD8+细胞的比值降低,其详细的机理还有待进一步的探究。     

原花青素A-1体内外对猪与小鼠T淋巴细胞亚群的影响

为研究从碎米花杜鹃叶中分离得到的化合物原花青素A-1（Proanthocyanidin A-1，简称PAA-1）的免疫增强活性，初步从细胞水平上探讨其免疫增强机制。体外试验采用流式细胞术，检测PAA-1体外对小鼠脾淋巴细胞T细胞亚群CD4和CD8单阳性和双阳性T淋巴细胞亚群百分率及CD4+/CD8+比值；体内试验通过饲喂不同剂量的PAA-1后，检测试验猪外周血淋巴细胞CD4和CD8单阳性以及CD4+/CD8+比值。结果证明，体外试验中同阴性对照组相比，PAA-1能单独或协同Con A提升具CD4+、CD8+及CD4+CD8+表型的T淋巴细胞亚群百分率，提高CD4+/CD8+的比值；体内试验中饲喂中、高剂量的PAA-1的试验猪外周血中具有CD4+、CD8+表型的T淋巴细胞的百分率及CD4+/CD8+的比值均有显著提高。说明PAA-1可通过增加辅助性T淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞数量、促进T淋巴细胞的成熟以及增加CD4+/CD8+的比值发挥增强细胞免疫的作用，为其进一步开发为新型免疫增强剂提供试验依据。