保存方法对牧草DNA提取效果的影响

为从野外采集的禾本科牧草样品中获得优质DNA,在有限的试验条件下找到最合适的样品保存方法。本研究在野外试验站采集了8种禾本科牧草,分别采用变色硅胶、-20℃、4℃、自然风干和45℃烘干等5种方法进行保存,保存一个月后进行DNA的提取。通过琼脂糖凝胶电泳、ISSR-PCR以及DNA的浓度和纯度对比,对几种保存方法下保存的牧草样品中所提取DNA的效果和质量进行鉴别。此外,为了解样品中多糖和多酚含量对DNA提取效果的影响,本研究还对采集样品多糖和多酚含量与DNA浓度和纯度进行了相关性分析。结果显示变色硅胶的保存效果最佳,烘干的保存效果最差,其他3种保存方法对不同植物的保存效果不能确定。多糖和多酚含量与DNA的提取效果、提取质量无明显关系,与DNA的浓度和纯度也无显著相关性,二者不是影响本研究DNA提取效果的主要因素,本研究中DNA提取效果的差异性是由于保存方法的不同造成的。在野外试验采集禾本科牧草样品时,如需要获得优质的DNA进行深入的试验,用变色硅胶保存样品,是一种便捷、效果优越的保存方法。     

基于MeDIP-seq研究蛋氨酸对巨噬细胞炎症中甲基化水平的影响

本课题组前期已研究表明蛋氨酸(Met)能缓解脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞的炎症反应,但其调控的分子机制尚不明确。本研究旨在从甲基化角度初步探讨DNA甲基化与Met抑制LPS诱导巨噬细胞炎症中分子机制的相关性。应用全基因组甲基化测序技术(MeDIP-seq)检测空白组、LPS组和LPS+Met组细胞的全基因DNA,每组3个重复。结果表明:LPS组甲基化峰(peak)的数量、总长度和覆盖率均高于空白组和LPS+Met组;与空白组相比,LPS组的高甲基化基因数在不同基因功能元件上均多于低甲基化基因数;与LPS组相比,Met+LPS组的低甲基化基因数在不同基因功能元件上均多于高甲基化基因数。运用GO富集和KEGG分析发现,LPS组与LPS+Met组差异甲基化基因主要富集在单一生物过程(Single-Organism Process)和细胞过程(CellularProcess),信号通路主要富集在Hippo信号通路。本研究为Met调控机体免疫和炎症反应提供一定的科学依据。     

鸡脂肪组织TCF21基因启动子区DNA甲基化与其表达的关系

旨在研究鸡脂肪组织中TCF21基因启动子区DNA甲基化水平与其表达的关系。以东北农业大学高、低腹脂双向选择品系（简称高、低脂系）第24世代7周龄肉鸡为试验材料，利用RT-qPCR检测高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因的mRNA表达水平；利用生物信息学和双荧光素酶报告系统分析TCF21基因启动子的结构与功能；利用Sequenom MassARRAY飞行质谱检测高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因启动子区CpG位点的甲基化水平；利用CpG甲基转移酶处理TCF21启动子报告基因质粒，分析DNA甲基化对TCF21基因启动子活性的影响。结果显示，高脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因的mRNA表达水平极显著高于低脂系（P<0.001）；TCF21基因的启动子区存在40个CpG位点，且在启动子的近端和远端均有分布，但不存在CpG岛；将TCF21基因的启动子划分为5个功能区域，分别为R1区域（-2 000~-1 500 bp）、R2区域（-1 500~-1 000 bp）、R3区域（-1 000~-500 bp）、R4区域（-500~-200 bp）和Core区域（-200~-100 bp）；高脂系R2、R3和R2+R3区域的DNA甲基化水平显著或极显著高于低脂系（P<0.05或P<0.001）；R2、R3、R2+R3区域的DNA甲基化水平与TCF21基因mRNA表达水平呈显著正相关（R2区域：r=0.438，P<0.05；R3区域：r=0.371，P<0.05；R2+R3区域：r=0.489，P<0.05）；R2区域的DNA甲基化显著抑制其转录活性（P<0.05）。综上所述，TCF21基因在高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中的表达水平主要与其启动子R2区域的DNA甲基化水平有关。     

不同保存温度和反复冻融次数对鸭疫里默氏杆菌DNA的影响

为探究不同保存温度和反复冻融次数对鸭疫里默氏杆菌DNA的影响,研究了不同保存温度和反复冻融次数对不同浓度梯度组鸭疫里默氏杆菌DNA样品浓度及荧光定量Ct值的影响.根据OmpA基因保守序列设计了鸭疫里默氏杆菌荧光定量PCR特异性引物,产物大小为112 bp,退火温度为56℃.荧光定量循环阈值Ct值随DNA浓度的下降而升高.常温保存的DNA样品7 d后出现明显降解,保存温度为4、-20、-80℃时则对荧光定量PCR检测效率影响不大.较高浓度的A、B组DNA样品Ct值未受冻融次数的影响,而浓度较低的C、D组则在冻融21次后Ct值明显升高.研究建立了鸭疫里默氏杆菌荧光定量PCR鉴定方法,Ct值随DNA浓度的下降而升高,DNA样品应低于4℃保存,低浓度DNA应避免反复冻融.     

高山马铃薯脱毒苗DNA甲基化的MSAP分析

为了解脱毒对高山马铃薯试管苗DNA甲基化水平的影响,探究DNA 甲基化在高山马铃薯脱毒后的作用,结合毛细管电泳检测技术对怀玉山高山马铃薯脱毒苗的基因组DNA甲基化进行MSAP分析。结果表明,怀玉山高山马铃薯常温继代带毒苗甲基化水平较高,经过玻璃化法超低温保存处理但未能脱毒时其甲基化水平有所下降,但甲基化仍处于较高水平,而常规茎尖培养脱毒和玻璃化法超低温疗法脱毒可明显降低试管苗的甲基化水平,且玻璃化法超低温疗法脱毒苗的甲基化水平更低。在怀玉山高山马铃薯超低温保存(未能脱毒)、茎尖常规培养脱毒和超低温疗法脱毒3个处理方式中,去甲基化模式和甲基化模式并存,但均以去甲基化模式为主要趋势,且在去甲基化模式的强弱依次为超低温疗法脱毒>茎尖常规培养脱毒>超低温保存(未脱毒)。本研究结果为怀玉山高山马铃薯脱毒苗的种质保存和规模化生产提供了一定的理论依据。     

基于DNA宏条形码的莼菜大田土壤真菌多样性研究

高通量测序与DNA条形码结合产生的DNA宏条形码技术(DNA-Metabarcoding),能快速鉴定混合样本中的物种,现已成为检测群类物种多样性和丰富度的常用方法.本试验采用这一方法分析了莼菜大田不同种植年限土壤真菌多样性,结果表明:10年生土壤中含有最多的真菌种类,多样性及丰富度最高;在属水平上表现为蛙粪霉属、裂梗霉属、酵母属等占优势;群类组成分析显示,种植年限的变化对土壤真菌群落组成有一定的影响;聚类分析中10年与15年生莼菜土壤物种多样性相似度较高.     

基于叶绿体DNA变异的怀山药鉴定体系构建

通过对20个怀山药和20个其他品种山药叶片总DNA序列比对发现,怀山药在叶绿体DNA片段trnQ-rps16上有210 bp的长度变异,同时在叶绿体DNA片段psbM-trnD上有1个特异碱基突变位点,会导致其他品种山药样品HinP1I酶切位点丢失。根据2个叶绿体DNA片段的序列差异构建怀山药鉴定体系。使用trnQ-rps16和psbM-trnD特异引物分别对山药总DNA进行扩增,trnQ-rps16扩增产物进行凝胶电泳检测,psbM-trnD扩增产物经HinP1I酶切后电泳检测,将检测结果与样品进行比较。采用该体系对29个怀山药以及62个其他品种山药进行检测,均得到正确结果。对20个随机采集的市售山药根状茎样品检测,发现17个为怀山药,3个为其他品种山药,该结果与实际山药品种一致,表明该怀山药鉴定体系适用于怀山药的识别,具有简便快速、结果准确以及适用性广的特点。     

玉米CMS-C同质异核、同核异质系叶绿体基因组比较分析

【目的】基于玉米细胞质雄性不育材料粗制线粒体DNA高通量测序数据,对叶绿体基因组进行组装。【方法】应用Illumina Hiseq 2500平台进行线粒体DNA测序。利用软件Velvet对过滤后的clean reads进行拼接和叶绿体基因组的组装。采用在线注释软件DOGMA(http://dogma.ccbb.utexas.edu/)对叶绿体基因组完整序列进行基因预测和基因功能分析。【结果】成功组装出C48-2和C黄早四2个不育系及48-2和黄早四2个保持系的叶绿体基因组,大小分别为140 473 bp(C48-2)、140 478 bp(C黄早四)、140 458 bp(48-2)、140 448 bp(黄早四),均包含84种编码基因,30种tRNA基因,4种r RNA基因。新组装的4个叶绿体基因组,在基因组大小及所包含的基因种类及数量方面都与叶绿体参考基因组具有较高的相似性,说明粗制线粒体的高通量测序数据可以用来组装叶绿体基因组。叶绿体基因组高度保守,但也存在SNP及InDel,基于不育系与保持系叶绿体DNA(cpDNA)的SNP位点设计特异引物,可用来鉴定区分CMS-C不育胞质与正常胞质。【结论】利用粗制线粒体DNA的高通量测序数据可以完成叶绿体基因组的组装,玉米CMS-C不育系与保持系的叶绿体基因组具有高度的一致性,但也存在一些多态性位点,基于多态性位点成功开发出可区分CMS-C不育胞质与正常胞质的特异标记。