拟穴青蟹Na+/H+ exchanger基因克隆及其在盐度胁迫下的表达分析

克隆了拟穴青蟹(Scylla paramamosain)Na~+/H~+-exchanger基因,其cDNA序列全长3 624 bp,开放阅读框(ORF)长2 886 bp,可编码961个氨基酸,预测蛋白质分子量和等电点分别为110.8 kDa和7.42,具有信号肽和典型的Na~+/H~+-exchanger蛋白结构域,含12个跨膜α螺旋。拟穴青蟹Na~+/H~+-exchanger的氨基酸序列与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的一致度最高,达到84.9%;该基因在卵巢中表达量最高,其次是精巢、鳃等;该基因在受精卵时期表达水平最高,大眼幼体时期次之。拟穴青蟹大眼幼体在低盐(盐度7和17)胁迫过程中,Na~+/H~+-exchanger基因在20 min表达水平最高,之后基本恢复到正常表达水平;在高盐(盐度37)胁迫(20 min～2 h)期间,该基因表达水平先下降再逐渐上升。Na~+/H~+-exchanger基因在拟穴青蟹大眼幼体阶段盐度适应中发挥着重要作用,且低盐显著诱导Na~+/H~+-exchanger基因的高表达,推测拟穴青蟹Na~+/H~+-exchanger基因在低盐环境下发挥重要的渗透调节功能。     

拟穴青蟹CYP302a1基因的克隆及表达模式分析

蜕皮激素对节肢动物生长、发育和繁殖有重要调控作用,细胞色素P450(CYP)302al是蜕皮激素合成通路中的关键酶。克隆获得了拟穴青蟹(Scylla paramamosain)CYP302a1基因,命名为Sp-CYP302a1。Sp-CYP302a1的cDNA序列长为3 032 bp,包含一个1 617 bp的开放阅读框(ORF),可编码538个氨基酸,预测相对分子质量为61.14 kDa。序列分析结果显示,该氨基酸含helix-K、helix-C、helix-I、PERF及heme-binding 5个P450特征保守区域。系统进化分析表明,Sp-CYP302A1与其他物种的CYP302Al聚为一类,与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)和凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)的进化关系最近。qRT-PCR分析发现,雌蟹和雄蟹中CYP302a1均在Y器官具有最高表达,而在其他组织中的表达量相对较低。在幼体发育过程中,CYP302a1在蚤状幼体Ⅲ期出现一个表达峰值,但在其他几个时期的表达量均较低。在蜕皮周期内,CYP302a1表达量变化显著,在蜕皮后期(A、B期)表达量最低,随后开始上升,至蜕皮前期(D期)达到最大值,随后开始下降。综上,研究从序列分析方面鉴定了拟穴青蟹的CYP302a1,并对该基因进行了表达模式综合分析,结果表明其可能在拟穴青蟹蜕皮以及幼体发育调控中具有重要作用。     

室内循环水可控软壳青蟹养殖技术初探

拟穴青蟹俗称青蟹,属甲壳纲、十足目、梭子蟹科、青蟹属,广泛分布于我国长江口以及南海沿海海域,是我国具有重要经济价值的海洋渔业资源和海水养殖品种之一。在东南沿海地区青蟹养殖已形成较为庞大的产业,成为当地重要的经济支柱,推动农民生活水平提高。     

赤拟谷盗章鱼胺受体3(TcOctβR3)cDNA克隆、表达及功能

【目的】章鱼胺信号系统在调节昆虫行为和生理过程中具有至关重要的作用。赤拟谷盗(Tribolium castaneum)作为一种模式昆虫,被广泛用于解析昆虫生长发育及生理等调控机制的研究工作。本研究以赤拟谷盗为对象,旨在明确章鱼胺受体在调节赤拟谷盗行为和生理方面的功能。【方法】根据Gen Bank登录的相关序列信息(XP_008198078),利用RT-PCR技术克隆赤拟谷盗章鱼胺受体基因Tc OctβR3的c DNA序列。利用在线生物信息学分析软件预测该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列以及跨膜结构域等信息,基于邻接法构建该基因与其他昆虫相关序列的系统发育树,明确系统进化关系。分别提取赤拟谷盗各发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)、不同组织(中枢神经系统、脂肪体、中肠、后肠、马氏管、精巢和卵巢)以及饥饿胁迫后的RNA,以赤拟谷盗核糖体蛋白S3(Tc RPS3)为内参基因,采用实时定量PCR技术分析该基因在赤拟谷盗不同发育阶段、不同组织以及在饥饿胁迫下的表达模式。运用哺乳动物异源表达系统在人胚胎肾细胞HEK293中瞬时表达Tc OctβR3,进而利用第二信使c AMP含量测定技术分析Tc OctβR3与配体的结合能力。最后,通过体外合成赤拟谷盗Tc OctβR3的双链RNA,利用RNA干扰以及轨迹球行为分析等技术探究该基因的生理功能。【结果】序列分析结果表明,赤拟谷盗Tc OctβR3开放阅读框全长1 305 bp,编码434个氨基酸,序列中含有G蛋白偶联受体典型的7个跨膜结构域。基于邻接法构建的系统发育树表明,该基因编码的蛋白质与小蜂甲(Aethina tumida)的OctβR3亲缘关系最近。实时定量PCR分析结果表明,Tc OctβR3在赤拟谷盗各发育阶段均有表达,尤其在低龄幼虫期转录水平最高,而在其他发育阶段表达量无显著差异;在赤拟谷盗不同组织中,Tc OctβR3在中枢神经系统的表达量显著高于其他组织;赤拟谷盗幼虫在经饥饿处理24 h的过程中,Tc OctβR3的表达量呈先下降后上升的趋势,且在处理6 h的表达量最低,为对照的0.47倍,在16 h表达量最高,为对照的1.80倍,最后恢复到正常水平。通过HEK293细胞异源表达Tc OctβR3后,c AMP测定结果表明章鱼胺(OA)呈浓度依赖性地激活Tc OctβR3,其EC50为8.68×10-7 mol·L-1,萘甲唑啉(NA)的激动活性最高,其有效中浓度EC50为8.56×10-8 mol·L-1。4种供试生物胺激动剂活性强弱为:萘甲唑啉酪胺(TA)章鱼胺多巴胺(DA)。进一步采用RNA干扰技术的分析结果表明,注射ds RNA能有效抑制Tc OctβR3的表达,沉默效率高达61.5%,但干扰该基因表达后不会影响赤拟谷盗成虫的爬行速度和产卵量。【结论】Tc OctβR3在赤拟谷盗中枢神经系统可能发挥重要作用,能调节幼虫对饥饿胁迫的响应。明确了Tc OctβR3的分子生物学特性,可为将来以其为靶标筛选高效激动剂和抑制剂提供理论依据。     

王行宽教授论治糖尿病的学术观点及临证经验

国家级名中医王行宽教授善于从心肝肾三脏论治糖尿病，认为心肝火旺、耗伤阴血为发病之本；心火亢盛，肝气郁结，郁火燔灼游行三焦，内外皆病，故善饥消渴；肾精亏损，阴阳不调，津液不布，燥热内生，发为消渴则是疾病演变的必然结果。王教授临床采用自拟消渴方清肝泻心、补益肝肾、滋阴润燥治疗消渴，获满意疗效。     

拟穴青蟹致病性副溶血弧菌分离鉴定及药敏试验

[目的]确定引起拟穴青蟹发病死亡的病原菌,并了解其致病性及药敏特性,为该病的临床诊断及科学防控提供理论依据,同时为保障拟穴青蟹养殖业的健康发展打下基础.[方法]采用常规细菌分离纯化方法从患病拟穴青蟹的病料组织中分离优势菌株,通过形态特征观察、生理生化特性鉴定及16S rDNA序列分析进行分类学鉴定,并进行人工感染试验、组织病理学观察及药敏特性分析.[结果]从患病拟穴青蟹肝胰腺中分离得到1株优势菌株(编号NS1SP18),菌株NS1SP18感染拟穴青蟹48 h的半数致死剂量(LD50)为3.18×104 CFU/g,感染发病拟穴青蟹呈现出多体液、偶有黑鳃及肝胰腺暗黄等症状,与自然发病拟穴青蟹的症状相似.综合菌株NS1SP18的形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析结果,可鉴定为副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus).患病拟穴青蟹的肝胰腺细胞发生变性;心肌纤维肿大,细胞坏死,有血淋巴浸润;网状鳃腔结构消失,脱落细胞阻塞鳃腔;肌纤维形变、断裂,局部坏死.菌株NS1SP18对氟苯尼考、恩诺沙星、四环素、多四环素、诺氟沙星、复方新诺明和庆大霉素等7种抗生素敏感,对麦迪霉素、万古霉素和阿莫西林已产生耐药性;对诃子、乌梅、苏木和八角茴香等4味中药极敏,对地榆、女贞子、山楂、五倍子、黄连、半枝莲、赤芍和救必应等8味中药高敏,对应的最小抑菌浓度(MIC)为7.81~31.25 mg/mL,最小杀菌浓度(MBC)为15.62~125.00 mg/mL.[结论]从患病拟穴青蟹分离获得的副溶血弧菌具有较强致病性,能造成严重的组织损伤而导致拟穴青蟹发病死亡.在拟穴青蟹养殖生产中,可适度选用氟苯尼考和恩诺沙星等抗生素抑制副溶血弧菌病暴发流行,或以诃子、乌梅、苏木和八角茴香等中药进行副溶血弧菌病防治.     

眼点拟微绿球藻养殖过程中细菌污染的治理方法

[目的]以进入中国饲料原料目录的眼点拟微绿球藻为研究对象,研究其在户外自然培养过程受到细菌污染时的污染治理方法及方法的应用。[方法]在硫酸庆大霉素、四环素、青霉素、红霉素和氯霉素为代表的5大类抗生素中筛选最佳的抗生素种类,并对藻液中抗生素残留进行氧化、紫外方法单独使用或结合使用等处理方法的研究。[结果]综合抗生素对藻细胞本身的影响和对细菌的治理效果结果,硫酸庆大霉素治理细菌效果最优,其次为四环素;红霉素对细菌无明显抑制作用;青霉素和氯霉素对藻细胞生长有明显的抑制作用。去除残留庆大霉素的有效方法为:在不含藻细胞的水体中可单独通入2 h的臭氧或加入100 mg/L高浓度有效氯溶液的方法可将硫酸庆大霉素去除95%以上,该方法可用作养殖清液或废液中硫酸庆大霉素的处理方法;在藻液中可使用15 mg/L的有效氯+紫外照射0.5 h的组合方法联合处理形式效果佳,藻液中的硫酸庆大霉素去除率在90%以上;藻细胞生长仅在初期受到轻微抑制作用,但细胞性状很快得到恢复,总体藻细胞的性状基本未受到明显的影响。[结论]针对户外眼点拟微绿球藻养殖过程中细菌污染可以使用硫酸庆大霉素进行治理,并可利用15 mg/L有效氯+紫外照射0.5 h将残留在藻液中的庆大霉素较好地去除,上述2种方法的结合使用可以保证户外养殖的持续进行,为眼点拟微绿球藻的规模化稳定养殖提供一种污染治理技术支撑,有利于该藻株的产业化进程。     

拟穴青蟹Cactus基因的cDNA克隆、序列及生物学功能

为获取拟穴青蟹Cactus基因cDNA全长、分析基本生物学信息,并初步探索其在病原物刺激下的免疫反应,实验采用RACE技术获得了拟穴青蟹Cactus(SpCactus)基因的cDNA全长序列,其cDNA全长为2035 bp,开放阅读框(ORF)1311 bp,编码436个氨基酸,分子量为46.01 ku。对蛋白理化性质进行预测发现,SpCactus为亲水性蛋白,等电点pI为4.91。经预测,SpCactus与其他物种的IκB蛋白具有相似的功能结构域。同源性比对结果显示,SpCactus与凡纳滨对虾和中国明对虾的Cactus蛋白同源性均高达62%,相似度为73%。系统进化树分析显示,SpCactus与甲壳动物聚为一支,与无脊椎动物聚为一大支。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测发现,SpCactus基因在拟穴青蟹不同组织中均有表达,肌肉中的表达量最高,其次为心脏、眼柄、血液和鳃,肝胰腺中的表达量最低。LPS和金黄色葡萄球菌刺激均能显著诱导SpCactus基因的表达。本实验成功扩增了SpCactus基因全长,并进行了生物信息学分析、理化性质预测,初步探讨了其生物学功能,为进一步研究其在免疫反应中的生物学功能提供参考依据。     

拥挤度和光照条件对赤拟谷盗成虫逃逸行为的影响

【目的】研究赤拟谷盗成虫逃逸活动规律和赤拟谷盗种群控制方法。【方法】以赤拟谷盗成虫为研究对象,分析赤拟谷盗成虫逐日逃逸现象,研究拥挤度、光照条件对其逃逸行为的影响。【结果】全黑暗和自然光周期条件下,赤拟谷盗成虫的逐日逃逸数量与拥挤度呈正相关;拥挤度达到50头/皿以上时,赤拟谷盗成虫逃逸行为频繁,且黑暗条件下的逃逸数量显著小于光照条件。【结论】光照对赤拟谷盗成虫的逃逸行为具有刺激作用,拥挤度的增加,有助于成虫逃逸。