大豆吡哆醇生物合成蛋白基因(PDX)的电子克隆和进化分析

电子克隆(In silicocloning)是随着基因组计划和EST计划实施而发展起来的利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。根据物种间同源基因相对保守的特点,以拟南芥(Arabidopsis thaliana)吡哆醇生物合成蛋白cDNA序列为信息探针,对大豆(Glycine max)EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了1 280 bp长的大豆吡哆醇生物合成蛋白的基因序列(GenBank登陆号为DQ139265)。经过RT-PCR扩增、基因组PCR扩增、分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆序列完全一致。该基因具有完整的开放阅读框架(ORF,20~955 bp),编码311个氨基酸。通过与水稻、日本百脉根、烟草、截形苜蓿等物种的吡哆醇生物合成蛋白序列比对,发现该基因具有高度的保守性。表明根据物种间同源基因序列,对跨物种间EST数据库进行同源检索、筛选、拼接,是克隆基因的有效途径。     

家蚕磷酸吡哆醇氧化酶cDNA克隆、鉴定及基因结构分析

 【目的】了解家蚕维生素B6关键代谢酶磷酸吡哆醇氧化酶（PNPO）的基因结构。【方法】利用生物信息学原理和PCR方法，克隆出编码家蚕（Bombyx mori）PNPO的cDNA（GenBank登录号：DQ452398）；采用T7启动子/T7 RNA聚合酶原核表达系统对cDNA进行体外表达，并通过酶活检测进行表达产物的功能鉴定；依据家蚕基因组数据库信息和得到的cDNA，对家蚕PNPO基因结构进行分析。【结果】克隆到的cDNA含有771 bp的完整可读框，编码一条分子量为29.86 kD、含257个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质与人类PNPO具有51.44%的同源性，包含PNPO家族共有的保守序列，但在人和大肠杆菌PNPO中具有重要作用的几个氨基酸残基在此蛋白质中被替换。在以磷酸吡哆醇（PNP）为底物时，表达产物Pro-PNPO的酶活力约为17 nmol•min-1•mg-1。家蚕PNPO基因包含5个外显子和4个内含子，跨越3.5 kb DNA序列，所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则，基因的5’端启动子调控区发现有TATA-box和CAAT-box保守基序。【结论】获得家蚕PNPO基因，可利用该基因在分子水平上研究家蚕的VB6代谢特征，弄清PNPO家族的特征及其在生物进化过程中的演变规律。     

磷酸吡哆醛补救途径两个关键酶的研究进展

维生素B_6(VB_6)包括6个可相互转换的吡啶衍生物。其中,磷酸吡哆醛(PLP)作为140多种细胞酶的辅酶,在生物体内发挥重要作用。动物从食物中获得VB_6,通过由吡哆醛激酶和磷酸吡哆醇氧化酶构成的补救途径合成PLP。PLP依赖酶的正常功能乃至人体最佳健康状态,依赖于细胞中PLP的平衡供给。然而,就PLP的动态平衡和调节机制以及PLP合成后的转移机制而言,目前还知之甚少,是一个富有挑战性的研究领域。为此,综述PLP补救途径两个关键酶的研究进展。     

吡哆醇离解常数及稀土络合物稳定常数的测定

本文用pH电位法测定了吡哆醇的离解常数得到数值为pK_14.99、pK_29.00。同时测定了La~(3+)、Gd~(3+)、Tm~(3+)与吡哆醇络合物的稳定常数。用Bjerrum法得到La、lgβ_12.72; Gd、lgβ_13.67、lgβ_26.34;Tm、lgβ_13.88,lgβ_26.73。由体系中络离子的分布状况可以得到生物学上有意义的结果。     

家蚕磷酸吡哆醇氧化酶在E.coli中的表达及酶学特征研究

磷酸吡哆醇氧化酶(pyridoxine-5′-phosphate oxidase,PNPO)是维生素B6(VB6)代谢的关键酶。采用重组质粒pET32a(+)-PNPO原核表达家蚕(Bombyx mori)PNPO,经Ni2+亲和层析纯化后对其基本酶学性质进行分析。结果表明,纯化后的家蚕重组PNPO经SDS-PAGE鉴定为单一条带,比活力为529.81nmol/(min·mg)蛋白,纯化倍数为7.1倍;该酶的最适反应温度为40℃,在50℃以下稳定;在pH8.0～9.0之间酶活力最高,pH6.0～10.0之间活力保持稳定。该结果有助于进一步开展家蚕PNPO的催化作用和表达调控机制的研究。     

家蚕酸吡哆醇氧化酶cDNA克隆、鉴定及基因结构分析

[目的]了解家蚕维生素B6关键代谢酶磷酸吡哆醇氧化酶(PNP0)的基因结构.[方法]利用生物信息学原理和PeR方法,克隆出编码家蚕(Bombyx mori)PNPO的cDNA(GenBank登录号:DQ452398);采用T7启动子/T7 RNA聚合酶原核表达系统对cDNA进行体外表达,并通过酶活检测进行表达产物的功能鉴定;依据家蚕基因组数据库信息和得到的cDNA,对家蚕PNPO基因结构进行分析.[结果]克隆到的cDNA含有771 bp的完整可读框,编码一条分子量为29.86 kD、含257个氨基酸残基的蛋白质.序列比对显示此蛋白质与人类PNPO具有51.44%的同源性,包含PNPO家族共有的保守序列,但在人和大肠杆菌PNPO中具有重要作用的几个氨基酸残基在此蛋白质中被替换.在以磷酸吡哆醇(PNP)为底物时,表达产物Pro-PNPO的酶活力约为17 nmol·min-1·mg-1.家蚕PNPO基因包含5个外显子和4个内含子,跨越3.5 kb DNA序列,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则,基因的5'端启动子调控区发现有TATA-box和CAAT-box保守基序.[结论]获得家蚕PNPO基因,可利用该基因在分子水平上研究家蚕的VB6代谢特征,弄清PNPO家族的特征及其在生物进化过程中的演变规律.     

RP-HPLC荧光检测法检测水产饲料中吡哆醇含量

建立了一种高效液相色谱-荧光检测法用于检测水产饲料中的吡哆醇含量。该方法灵敏度高,检出限为5mg/kg,定量限为15 mg/kg,回收率在86.97%~91.41%之间,相对标准偏差为1.02%,方法准确、灵敏、快速,达到实验的要求,适用于水产饲料中吡哆醇的检测。     

截形苜蓿吡哆醇生物合成基因的电子克隆和进化分析

电子克隆是随着基因组计划和EST计划实施而发展起来的、利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学的方法,以拟南芥吡哆醇生物合成蛋白基因(PDX)cDNA序列为探针,在GenBank的HTGs数据库中找到与之高度同源的截形苜蓿的基因组序列———m th2-17p16克隆,通过GenScan软件预测和序列拼接得到了截形苜蓿吡哆醇生物合成基因序列(GenBank登录号为DQ139263)。用该序列对GenBank中的est-others进行相似性搜索,获得了25条截形苜蓿的EST序列,经拼接后发现与基因组预测的基因序列一致,表明该基因是真实存在和表达的。该cDNA序列长度为1 257 bp,具有完整的开放式阅读框(ORF 29-973bp),推测编码314个氨基酸。通过对日本百脉根(Lotus corniculatusvar.japoni-cus)、烟草(Nicotiana tabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine max)、小麦(Triticum aestivum)和水稻(O ryza sativa)等进行吡哆醇生物合成蛋白序列同源比较,发现该基因具有高度的保守性。