小体鲟卵黄雌性蛋白分离纯化及抗血清的研制

采用凝胶柱层析法,对小体鲟(Acipenser ruthenusLinnaeus)卵黄蛋白粗提液进行分离纯化。小体鲟卵黄蛋白粗提液的质量浓度为25.04 mg/mL,经Sephadex G-200层析后出现3个蛋白峰。用聚丙烯凝胶电泳、免疫印迹(Western-blotting)和免疫扩散等方法研究表明,小体鲟卵黄蛋白由分子量分别为132.1 kD、97.4 kD、85.9 kD、67.0 kD、59.2 kD、47.6 kD、30 kD、14.3 kD和12.8 kD的9个亚基组成;层析后峰B蛋白为卵黄雌性特异蛋白(yolk female specific protein,YFSP),是一种糖脂磷蛋白,具有雌性特异性和组织特异性,抗体具有种属特异性。Western-blotting结果表明,卵黄雌性特异蛋白(YFSP)与血清雌性蛋白(FSSP)免疫印迹图谱上都显示分子量为97.4 kD和30 kD的2条杂交带,可见两种蛋白在免疫原性上具有相似性,可以用卵黄雌性蛋白抗血清代替卵黄蛋白原抗血清对卵黄蛋白原进行检测     

不同倍性虹鳟卵黄蛋白原的组织定位

采用分步沉淀法提纯虹鳟卵黄蛋白,以同发育期二倍体虹鳟为对照,用免疫组化法对不同发育阶段的三倍体虹鳟性腺、肝脏、血液和肠道进行卵黄蛋白原(Vg)的细胞化学定位研究.试验结果表明:所纯化蛋白为与卵黄蛋白原具有相似免疫原性的卵黄脂磷蛋白,呈雌性特异性.性腺发育Ⅲ～Ⅴ期的二倍体雌性虹鳟,血液和肝细胞呈卵黄蛋白原阳性,Ⅳ～Ⅴ期卵巢呈卵黄蛋白原阳性,各发育期肠组织呈卵黄蛋白原阴性;性腺发育至Ⅰ～Ⅴ期的三倍体雌雄虹鳟及雄性二倍体虹鳟,其性腺、肝脏、血液和肠道组织呈卵黄蛋白原阴性.二倍体虹鳟外源性卵黄蛋白原在肝细胞内合成,经血液运送至卵巢,最终在卵母细胞中形成卵黄颗粒.由于三倍体雌性虹鳟卵巢发育受阻,无滤泡细胞分化,生殖细胞与体细胞的互作缺失,不能分泌足量的17β-E2以诱导Vg的合成,因而肝脏的Vg阴性并不能说明肝脏不具备合成Vg的能力,从卵黄发生的角度分析,卵黄蛋白原的缺乏不是导致三倍体虹鳟雌性不育的原因,而是其卵泡败育的结果.     

中华鲟血清卵黄蛋白原水平的初步观察

通过碱不稳定性蛋白结合磷法测定不同年龄中华鲟(Acipenser sinensis)血清中磷含量,以磷的含量变化反映卵黄蛋白原(VTG)变化情况。实验鱼为人工养殖0.5、1、2、3、4、5、6、8、9、10龄中华鲟和野生成熟中华鲟,共81尾,其中8尾野生雌鱼在人工繁殖前后各取样2~4次,共测97个血液样本。结果显示:低龄中华鲟VTG含量较低,最低值在5龄,含磷量为(4.6±1.6)mg/L,5龄后增加,成熟后达到最大,含磷量为(52.0±4.5)mg/L。在性腺不同发育时期,雌性个体在Ⅱ~Ⅴ期VTG的含量增加,Ⅱ~Ⅲ期增加速度较快,随后变缓,Ⅴ期达到最高水平,Ⅵ期降低;而雄性个体在Ⅱ~Ⅳ期VTG的增加量很少,Ⅳ期达到最高水平,含磷量为(28.7±12.2)mg/L。繁殖雌鱼产前VTG含量最高,含磷量为(62.5±8.7)mg/L,产后低于产前。此外,发现产后鲟鱼卵巢液中含量低于其血清中含量,但高于其他年龄组血清中的水平。本实验表明淡水养殖的中华鲟有可能达到性成熟。     

小体鲟血清卵黄蛋白原和 Ca2+浓度与卵巢发育的关系

采用ELISA方法、分光光度计法和组织学方法,系统研究了不同年龄小体鲟(Acipenser ruthenus)血清卵黄蛋白原(Vitellogenin Vg)、血清钙离子(Galcium Ca2+)含量与卵巢发育变化的关系.结果表明:血清Vg浓度、Ca2+浓度与卵巢的发育时期相关;在卵黄沉积期内,血清中Vg浓度与Ca2+浓度呈线性正相关(R2=0.926 4);卵黄生成前期和沉积初期,血清中Vg浓度和Ca2+含量较低;卵黄沉积期内,卵母细胞由沉积初期的0.56 mm 增大到卵黄沉积末期的2.0l mm,血清Vg质量浓度由110.65 μg/mL 上升到242.22 μg/mL,血清Ca2+浓度由2.34 mol/L增大到2.72 mol/L.对同年龄的雌、雄小体鲟血清Vg浓度和Ca2+浓度测定表明,根据血清中Vg和Ca2+含量差别,可以区分出沉积期小体鲟的性别.     

己烯雌酚和辛基酚对真鲷幼鱼的雌激素效应研究

采用静态暴露方式研究己烯雌酚(DES)和辛基酚(OP)对真鲷幼鱼的雌激素效应.当真鲷幼鱼分别暴露于一定浓度的DES和OP,42 d后,真鲷幼鱼的肥满度均极显著下降;血浆中卵黄蛋白原被诱导产生,肝胰脏指数和血浆蛋白总量极显著升高.试验结果表明,真鲷幼鱼的肥满度、肝胰脏指数、血浆蛋白总量等可作为评估DES和OP等环境雌激素毒性效应的生物指标;真鲷幼鱼血浆中的卵黄蛋白原可作为生物标志物,用于监测海洋水体DES和OP等环境雌激素的污染.     

实时定量RT-PCR方法评价壬基酚的雌激素效应

壬基酚是1种环境雌激素物质,以血清卵黄蛋白原作为生物标记物检测壬基酚的最低雌激素效应浓度高于10μg/L.利用亚成体青鱼进行不同浓度的(1、10、50、100μg/L)壬基酚暴露实验,运用实时定量RT-PCR方法,从分子水平上,对青鱼VTG-Ⅰ、VTG-Ⅱ、CHG-H和CHG-L的基因表达进行了研究,并对低浓度壬基酚的环境雌激素效应进行了分析.结果表明:1μg/L浓度的壬基酚暴露组青鱼肝脏的VTG-Ⅰ、VTG-Ⅱ、CHG-H、CHG-L基因表达均被显著诱导,说明实时定量RT-PCR能够检测1μg/L壬基酚     

鳗鲡卵黄蛋白的生物效应

鳗鲡卵黄蛋白制备物与血清在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分别呈现出2条相对应的蛋白区带,迁移率(R_f)相同。对照组雌鳗经5次和7次注射HCG与CPG后,成熟系数(GSI)分别为(11.94±2.83)%和(46.04±6.22)%,血清中17β-雌二醇(17β-E_2)浓度为(0.665±0.431)ng/ml和(0.421±0.010)ng/ml,睾酮(T)为(4.603±3.442)ng/ml和(3.817±1.399)ng/ml,经HCG.CPG与鳗鲡卵黄蛋白三者混合注射5次和7次后,GSI分别为(16.53±6.67)%和(53.23±11.25)%,血清中17β-E_2浓度为(1.036±0.316)ng/ml和(0.411±0.068)ng/ml,T为(11.170±5.818)ng/ml和(3.956±1.780)ng/ml。未经注射催情药物的雌鳗GSI为(0.50±0.32)%,血清中17β-E_2和T浓度低,检测不出。试验结果证明,外源性鳗鲡卵黄蛋白与HCG和CPG三者混合注射具有明显的促进鳗鲡卵巢加速发育成熟的作用。     

中国对虾卵黄蛋白原合成部位的研究

十足目甲壳类卵巢中卵黄的来源,在过去的几十年研究中一直存在争议,内源性合成和外源性合成都有报道。本文以雌性中国对虾为实验材料,根据组织学观察确定其发育阶段,试验虾可以分为:卵巢未发育期;卵黄发生前期;初级卵黄发生期和次级卵黄发生期4个时期。从处于不同卵巢发育期对虾的卵巢和肝胰腺中提取总RNA,用RT-PCR的方法初步探讨不同发育期的中国对虾卵巢和肝胰腺中卵黄蛋白原mRNA的表达,确定是否存在卵黄蛋白原的合成功能。结果发现,从卵巢未发育期到次级卵黄发生期的卵巢和肝胰腺中都有卵黄蛋白原mRNA的表达,说明二者为卵黄蛋白的合成部位。     

外源性卵黄蛋白对鳗鲡GTH细胞和卵母细胞超微结构的影响

外源性卵黄蛋白与鲤鱼垂体（CPG）加绒毛膜促性腺激素（HCG）混合注射（试验组）对鳗鲡具有明显的催热作用，卵巢成热系数平均为56．17±11．74％，是对照组（CPG加HCG组）的2．87倍。试验组脑垂体促性腺激素细胞（GTH细胞）中除含有数量较多的小分泌颗粒外，球状分泌颗粒增加，内质网池扩大；卵母细胞直径为450．0微米，双层滤泡膜和放射带充分发育。对照组GTH细胞的球状分泌颗粒直径和内质网扩大均小于试验组；卵母细胞直径为270．0微米。而饲养在海水中75天，未经注射催情药物的雌鳗，脑垂体GTH细胞仅有小分泌颗粒，未见球状分泌颗粒，卵母细胞的放射带正在形成，胞内开始出现脂肪油球。试验结果表明，外源性卵黄蛋白与CPG加HCG混合注射有明显协同作用，对卵母细胞成热有显著促进作用。     

桑蚕卵黄蛋白含量及其生理功能研究

昆虫卵黄蛋白的研究是近年来昆虫生理学和生化学最活跃的领域之一。桑蚕是鳞翅目昆虫,其卵黄系统和其它昆虫有所不同,卵黄蛋白质主要包括三种蛋白质分子,即卵黄磷蛋白(Vitellin,简称Vtn)、卵特异蛋白(egg-specific protein,简称ESP)和30K道尔顿蛋白(30KDa protein,简称30KP)。自70年代以来,国内外学者对它们的生物合成、理化性质、激素调节等进行了广泛的研究。但对桑蚕三种卵黄蛋白的生理功能却缺乏详细的报道,且前人的研究多局限于某一蚕品种,从未对不同蚕品种间三种卵黄蛋白的含量、组成及在胚胎发育中的