转录组学技术在水产动物研究中的运用

近年来,转录组学技术及其在水产动物中的研究备受研究者的广泛关注.转录组学技术主要有基于杂交技术和测序技术为基础的两大类技术;两类技术在水产动物的转录组学研究中均得到了广泛运用.尤其是二代测序技术的出现使得水产动物的转录组学研究达到了前所未有的热度.本实验综述了近年来水产动物在免疫应答、生长发育、生物进化和毒理学方面的转录组学研究进展.在综述已有成果的基础上,分析了转录组学技术自身存在的局限性和现阶段转录组学在水产动物研究中面临的问题与挑战,并对未来水产动物转录组学研究趋势进行了展望.  

三疣梭子蟹生长相关SNP位点的鉴定

为了发掘三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)与生长相关的SNP,本研究基于三疣梭子蟹比较转录组学数据,筛选出生长相关候选基因片段19条,利用该基因序列设计引物进行PCR扩增,得到总长为17 387 bp的DNA片段;通过直接测序法发现74个SNP位点,分布频率为0.43/100 bp,其中转换突变的比例为80%,颠换突变的比例为20%,转换的比例远远大于颠换,符合"transition bias"原理。C/T(G/A)突变所占比例为60%,G/T(C/A)突变占20%,A/T突变占9.33%,G/C突变占10.67%,C/T(G/A)突变所占比例最大。内含子上突变发生的频率为1.34/100 bp,外显子上仅为0.17/100 bp,说明外显子上的碱基更加保守。通过飞行质谱法,在三疣梭子蟹生长性状分离群体中成功分型了10个SNP位点;通过卡方检验和多元方差分析的方法进行性状关联分析,发现3个SNP位点与生长性状显著相关(P<0.05),并且comp58070-R31位点与生长性状极显著相关(P<0.01);一般线性模型的多元方差分析显示,comp58070-R31位点与体重、全甲宽、甲宽3个性状极显著相关(P<0.01),与体长、体高2个性状为显著相关(P<0.05);comp46623-F49位点与甲宽显著相关(P=0.05);comp49193-R333位点与甲宽显著相关(P<0.05)。通过对SNP位点的多态性分析发现,三疣梭子蟹SNP标记观测杂合度(Ho)范围为0.162 8~0.833 3,期望杂合度(He)范围为0.189 6~0.591 2,并且显示SNP标记的信息量低于微卫星标记。该研究的结果将有助于推进三疣梭子蟹分子标记辅助育种进程。  

不同光周期条件下日本牙鲆尾部神经分泌系统转录组分析

为发掘日本牙鲆响应光周期变化的重要功能基因,采用新一代高通量测序RNA-seq技术分析8L∶ 16D、12L∶ 12D和16L∶ 8D等3个光周期条件下日本牙鲆尾部神经分泌系统(caudal neurosecretory system,CNSS)的基因表达变化.转录组测序结果显示,3个样品分别产生了5 807 622、6 147 140和6 116 872个Clean reads.分别对8L∶16D、12L∶ 12D和16L∶8D条件下的文库进行两两比较,共获得200个差异表达基因.GO分类分析表明,差异表达基因属于生物学过程、细胞定位和分子功能的42个类别.KEGG Pathway显著性富集分析差异表达基因共涉及29条代谢途径,包括糖酵解/糖异生、钙离子信号转导、血管平滑肌收缩和光信号转导等通路.上述结果不仅加深了对鱼类尾部神经分泌系统功能的认识,也为进一步探索硬骨鱼类光信号转导机制提供了多方面多层次的信息.  

基于牙鲆RNA-seq数据中SSR标记的信息分析

通过对牙鲆(Paralichthys olivaceus)进行转录组测序(RNA-seq),利用MicroSAtellite (MISA)软件对1～6个碱基重复、碱基数在10 bp以上的微卫星进行鉴定.结果表明,牙鲆转录组水平上,共发现42 183个SSR位点,分布在26 457条Unigene上,发生频率为27.12％,平均密度为339个/Mbp.获得的SSR一共有216种重复基元,其中二核苷酸重复基元类型数量最多,共有17 570个,占所鉴定SSR总数的41.65％.同时用SPSS statistics 20.0软件对牙鲆转录组SSR的多态性进行了评估.  

转录组测序研究三角帆蚌珍珠颜色相关基因

【目的】为筛选影响三角帆蚌珍珠颜色的候选基因,【方法】采用转录组测序平台Illumina HiSeqTM 2500对蚌壳珍珠层颜色为紫色和白色的三角帆蚌的中央膜组织进行高通量测序。所得序列经质控、组装后比对到NR、Swiss-Prot、COG、KOG、KEGG、GO和Pfam数据库中注释,并进行差异基因聚类分析。【结果】结果表明：获得干净数据共72 800 581 bp,拼接获得了89 529个Unigene,差异表达基因2 644个,其中上调表达基因1 323个,下调表达基因1 321个。转录组数据经筛查共得到7 539个微卫星标记和1 759 869个单核苷酸多态性标记。根据GO功能分类可以分为3大类包括分子功能、细胞组分和生物过程和50分支；根据KEGG代谢通路分析可以分为187类。对差异表达基因分析发现,有些基因与色素(血红素、黑色素、虾红素)有关,还有6个细胞色素P450,3个细胞色素b561和1个细胞色素b560。【结论】这些基因可能在珍珠颜色形成中发挥作用。  

正常与性早熟中华绒螯蟹的Y-器官转录组分析

性早熟是中华绒螯蟹养殖过程中普遍存在的一个问题.为发掘中华绒螯蟹性早熟相关的重要功能基因,实验采用Illumina Hiseq 2000高通量测序技术获得了正常与性早熟雌蟹的Y-器官转录组数据,并进行比较分析.结果显示,测序分别获得44619538和43052958个clean reads,比对发现2655个差异表达基因,Gene Ontology(GO)功能分类分析将文库中的差异表达基因归类到3大功能(生物过程、细胞组分和分子功能)的42个类别中.KEGG富集分析将文库中的差异表达基因富集到134条特定的KEGG代谢途径,其中4条是显著性富集,包括酮体合成和降解、丁酸甲酯代谢、神经营养因子信号通路和碱基切除修复通路.通过RNA-seq技术获得了丰富的中华绒螯蟹Y-器官转录组信息,为中华绒螯蟹新基因克隆、性早熟成因与预防和Y-器官的研究提供有价值的数据.  

栉孔扇贝在镉污染胁迫下消化盲囊组织的转录组分析

镉(Cd)作为生物非必需、毒性极强的蓄积性重金属,易通过食物链进入人体,严重威胁人类健康.扇贝相对于其他贝类具有特异性蓄积镉的能力,成为水产品安全领域关注的焦点.为了阐释扇贝高蓄积镉的分子机制,本研究以镉胁迫的栉孔扇贝(Chlamys farreri)消化盲囊组织为研究对象,通过转录组测序技术进行基因转录水平分析.通过比较转录组拼接获得105071个unigene和3800个差异基因,对所得unigene进行功能注释,发现这些基因集中在蛋白绑定、细胞黏附、免疫应答、细胞凋亡和能量代谢等方面.对这些蛋白的分子功能进行注释,发现该类蛋白主要属结合蛋白(40.45%)、催化活性蛋白(34.27%)和转运蛋白(5.62%).这些功能基因和预测通路为理解扇贝体内解毒和免疫系统奠定了基础.获得的转录组数据为深入研究双壳贝类应对海洋污染物的分子机制提供了丰富的基因资源.  

基于转录组测序对翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)2种肌球蛋白重链基因的克隆与分析

肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MYH)是骨骼肌粗肌丝的重要组成单位,其表达量高低影响肌纤维的组成和肌肉生长.为了解其在翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)早期生长过程中的作用,本研究从前期生长差异显著的2组(快长组和慢长组)翘嘴鳜幼鱼转录组差异表达Unigene中筛选出2个MYH基因,RACE (Rapid amplification of cDNA ends)克隆到其全长cDNA(MYH-7a,MYH-7b).MYH-7a全长为6071bp,开放阅读框为5820 bp;MYH-7b全长为5896 bp,开放阅读框为5745 bp.序列分析显示,2个MYH均有Loopl、Loop2环、ATP结合位点等关键结构域;进化树聚类分析显示,MYH-7a与MYH-7b均属于慢肌球蛋白.实时荧光定量PCR验证发现,其在快长组样本中表达量显著高于慢长组,与转录组测序结果一致;检测其在翘嘴鳜心肌、红白肌和皮肤等14种组织的表达水平,结果显示,MYH-7a主要在心肌中表达,而MYH-7b主要在红肌中表达;在胚胎发育不同阶段,二者随着胚胎发育的进行,表达量不断增加;在幼鱼早期生长过程(孵化出膜后15 dph、30 dph和60 dph)的翘嘴鳜白肌中,在15 dph和30 dph快长组的表达量显著高于慢长组,而到60 dph时快长组的表达量均显著低于慢长组.翘嘴鳜MYH-7a、MYH-7b在快长组与慢长组鱼中的差异表达提示它们在翘嘴鳜胚胎及其早期生长发育过程中发挥重要作用.  

饲料VD3水平对黄颡鱼转录组差异基因表达的影响

为研究饲料中添加维生素D3对黄颡鱼基因表达的影响,实验基于RNA-Seq技术对用添加不同水平维生素D3[0(VD0),1243(VD2),22 700(VD20) IU/kg]的饲料喂养的黄颡鱼肾脏和小肠的转录组数据进行分析.通过对305 568982条原始reads的筛选和排除,得到了83265条unigenes,平均长845.38 nt,N50为1620 nt.利用Blast等相关软件对数据进行深度分析,得到功能注释基因共29 224个.根据GO富集分析发现,差异表达基因主要集中在细胞过程、代谢通路、生物调控等通路中,KEGG pathway富集分析结果显示,代谢通路涉及基因最多,有1532个.相对于对照组,添加1243和22 700 IU/kg的VD3(VD0 vs VD2/VD0vs VD20)可得到共同上下调基因共380个,其中上调基因266个,下调基因114个;3种水平下共同上下调的基因共21个,其中上调基因4个,下调基因17个.研究表明,在饲料中添加不同浓度维生素D3会对黄颡鱼的生长代谢和生物调控等相关基因表达产生影响,且不同浓度实验组,相关基因的表达存在差异.本实验通过对差异表达基因的后续分析及预测,为黄颡鱼的生长代谢及疾病预防等方面的研究提供了丰富的数据来源.  

低盐胁迫下坛紫菜叶状体的转录组分析

为探索坛紫菜叶状体响应低盐胁迫的分子生理学机制,本研究采用第二代高通量测序技术,分析比较在正常盐度(26,对照组)和低盐度(3,胁迫组)下培养不同时间(3、6和9 h)的坛紫菜叶状体转录组数据.结果显示,测序数据经de novo组装,获得了33 872条unigenes,平均长度为612 bp;与对照组相比,3个胁迫组分别产生了1 108、1638和1881条差异性表达基因.GO功能富集分析显示,一些可能与低盐胁迫相关的重要生物过程得到了显著富集,如单分子有机物代谢过程,单糖的合成代谢和分解过程,糖质新生,有机物分解代谢过程等.KEGG代谢通路富集分析发现,低盐胁迫不同时间富集到的代谢通路存在很大差异,低盐胁迫3h响应的差异性表达基因富集到3个KEGG代谢通路,其中2个与氨基酸合成相关,1个与光合作用相关;而低盐胁迫6和9h的差异性表达基因则大多富集到与糖类功能相关的代谢通路.荧光定量PCR (qRT-PCR)验证结果显示,所选取的8个差异性表达基因的表达趋势与高通量测序结果相一致.上述结果说明,坛紫菜叶状体在受到低盐胁迫时,应激反应具有时间特异性,早期主要通过合成或者降解蛋白质来抵御低盐环境,随着胁迫时间延长,细胞通过改变可溶性物质的含量、减慢能量代谢等途径以抵御低盐逆境.