[05]鳜脂蛋白脂酶和肝脂酶基因结构与组织表达

为了研究鳜(Sinioerca chuatsi)脂蛋白脂酶(LPL)、肝脂酶(HL)基因结构与功能关系,首先采用RT-PCR及RACE法,克隆得到鳜肝脏LPL与HL基因cDNA全序列.鳜肝脏LPL基因cDNA全长为2089 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 548 bp,编码515个氨基酸.鳜HL基因cDNA全长为1 964 bp,其中ORF为1 494 bp,编码497个氨基酸.进化树分析显示,鳜LPL与HL基因与其他脊椎动物的LPL、HL基因各自聚集成簇.对鳜基因组进行PCR获得鳜LPL与HL全基因组DNA序列,与其他脊椎动物基因结构相似,鳜LPL基因由10个外显子和9个内含子组成,全长7 392 bp;鳜HL基因南9个外显子和8个内含子组成,全长8 837 bp.应用Genome Walker方法在鳜克隆得到一段长为1 071 bp的LPL和一段长为2 173 bp的HL基因5'侧翼Ⅸ序列,并利用相关软件预测其中具有多个保守的顺式调控元件.组织表达研究显示与易患动脉粥样硬化的人类LPL不同,鳜LPL基因在所有被检测组织中均有表达:在脂肪组织中大量表达,其次是肝脏、脑、肠道、肌肉,在脾中表达量最低;而鳜HL基因的表达则与人类相似,只在肝脏中表达.本研究将为深入探讨机体脂质代谢调节机制以及LPL、HL在防治动脉粥样硬化中的作用奠定良好基础.  

淇河鲫IL-8 cDNA克隆及组织表达分析

IL-8是最早发现的趋化因子,属于CXC亚家族,与鱼类非特异性免疫水平关系密切。实验采用同源克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)方法,从淇河鲫总RNA反转录产物中获得了641 bp IL-8cDNA序列,其中包含102 bp的5’非编码区,242 bp的3’非编码区和297 bp的开放阅读框。该基因编码由98个氨基酸残基组成的前体蛋白,前22个氨基酸残基为信号肽。肽链中含有4个保守半胱氨酸,前2个半胱氨酸被1个精氨酸分隔,形成CXC结构。第一个半胱氨酸前缺乏ELR基序,其组成是DPR。由氨基酸同源性分析和进化分析可知,淇河鲫IL-8与鲤、鳙、草鱼、鲢等鲤科鱼类的进化关系较近,与鲤IL-8的同源性最高(94%)。通过实时荧光定量PCR检测,淇河鲫IL-8在被检测的8个组织中都有表达,其中在肌肉中的表达量最高,其次为脾脏、头肾和脑等。研究结果对调控淇河鲫非特异性免疫能力,提高淇河鲫健康养殖水平具有一定参考价值。  

泥鳅肌肉生长抑制素基因片断的克隆及其表达

肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）是动物肌肉生长发育的负调控因子。以泥鳅肌肉cDNA为模板，采用RT-PCR法克隆了泥鳅MSTN基因的主要片段,其长度为815 bp，编码271个氨基酸残基。泥鳅MSTN具有MSTN的共同特征，有蛋白酶水解位点RIRR和保守的半胱氨酸残基。RT-PCR分析表明该基因在肌肉中显著表达，在眼中也有微弱表达，而在其他所检测组织（脑、鳃、心脏、肝脏、肠、精巢、卵巢）未见表达。此结果表明泥鳅MSTN基因除对肌肉生长发育有调控作用以外，还可能在眼的发育中有一定作用  

罗氏沼虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆与表达

谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)是一种广泛分布在动植物体内的酶,并参与细胞多种代谢调控。在甲壳动物中,GS在能量代谢和渗透压调节过程中起着重要作用。实验克隆了罗氏沼虾GS基因。GS基因cDNA全长1 965 bp,开放读码框(ORF)为1 086 bp,编码361个氨基酸(aa),分子量大小为40.75 ku,等电点为5.81。进化树分析发现,罗氏沼虾GS基因与凡纳滨对虾、斑节对虾和中国明对虾GS聚为一支,氨基酸相似性达到95%。氨基酸多序列比对分析结果显示,罗氏沼虾GS属于无脊椎动物分支的GSⅡ群,有5个保守区域。实验对罗氏沼虾GS蛋白进行表达并制备了多克隆抗体。采用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)对罗氏沼虾蜕壳前后的不同组织GS表达进行检测。qRT-PCR结果显示,GS基因在所检测的8个组织中均有表达;蜕壳前,其相对表达量顺序为:肝胰脏肌肉胃肠鳃心脏脑血淋巴。蜕壳后和蜕壳前GS基因在组织中的差异表达比较结果显示,除了在肝胰脏表达下调外,其他7个组织都表达升高,其相对表达量的差异顺序为:脑鳃胃肠肌肉心脏血淋巴。Westernblot结果显示,蜕壳后GS蛋白在鳃和肌肉组织表达量上调,与其mRNA表达一致。此外,罗氏沼虾蜕壳后肝胰脏GS酶的活性和谷氨酰胺的含量下调,而其在鳃、肌肉和血淋巴中上调,结果与其基因表达一致。研究表明,GS基因在不同组织中表达的差异可能和罗氏沼虾的能量代谢、渗透压调节有关。  

黄颡鱼脑P-450芳香化酶基因的克隆和组织表达

P-450芳香化酶（P450arom）是催化雄激素生物合成雌激素的关键酶。本文采用RT-PCR和RACE法，首次分离和克隆了黄颡鱼脑P450芳香酶基因HP450aromB，并使用荧光实时定量RT-PCR对其组织表达进行了研究。结果表明HP450aromB cDNA全长2080bp（不包括poly（A）），5′端非翻译区有25bp，3′端555bp（不包含poly（A）），阅读框（open reading frame，ORF）1500bp，编码500个氨基酸，推测的蛋白质分子量为56kDa。同源性分析显示，HP450aromB的氨基酸序列与其它鱼脑P450arom具有70％以上的同源性，与其它鱼卵巢P450arom为60％左右同源，与人胚盘和鸡卵巢P450arom则为50％左右同源；但芳香化酶高保守区包括Ⅰ-螺旋区，芳香化酶特异保守区Ⅱ及血红系结合区Ⅲ和其它鱼芳香化酶相比同源性分别为83％～96％，78％～86％和85％～100％。系统发育分析表明HP450aromB与鱼类脑P450arom属于同一分支的，并且也显示了黄颡鱼和鲶鱼分类地位最近，这和传统的分类一致。实时定量RT-PCR研究显示，HP460arom B在前脑，下丘脑，垂体、卵巢、精巢均有表达，在肝脏没表达，表达量脑部高于性腺，但雌雄鱼脑部HP450aromB的表达总量没显著差异。  

拟穴青蟹14-3-3基因全长cDNA的克隆及组织表达分析

采用RT-PCR及RACE技术,从拟穴青蟹眼柄组织中克隆获得14-3-3基因cDNA全序列.序列分析结果表明:拟穴青蟹14-3-3基因全长1112bp,开放阅读框长744 bp,编码由247个氨基酸组成的蛋白,分子量为28.086 ku,等电点为4.675.与其他物种14-3-3基因氨基酸序列进行同源性比较分析显示,拟穴青蟹14-3-3基因与斑节对虾14-3-3基因同源性最高(95％),依次为墨吉对虾(93％)、苜蓿切叶蜂(92％).聚类分析表明,拟穴青蟹14-3-3基因氨基酸序列与斑节对虾、墨吉对虾紧密聚为一支.经荧光定量检测,拟穴青蟹14-3-3基因在肝胰腺和肌肉中的表达量较高,其次为鳃、眼柄、心脏和肠,在胃中表达最少.盐度骤变实验结果表明:盐度胁迫24 h后,盐度的下降(5)或者上升(15、20、25、30)都引起了14-3-3基因在鳃中的表达量极显著上升(P＜0.01),盐度变化的幅度越大,14-3-3基因的表达量越多.实验结果为进一步深入研究14-3-3基因的功能及调控机理奠定基础.  

中华鳖MyD88部分序列克隆及其在组织中的表达差异分析

MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)是多数TLRs(Toll like receptor,TLRs)信号转导过程中的关键接头分子。研究根据MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)TIR结构域(Toll-like/IL-1 receptor domain)保守区设计简并引物,通过PCR扩增,成功地从中华鳖脾脏cDNA中扩增出351bp的目标序列。测序后经结构域和序列比较分析,扩增片段为中华鳖的MyD88 TIR结构域。该序列与大黄鱼、鸡等脊椎动物的MyD88的TIR结构域序列同源性和相似性分别为72.9%～86%和77.6%～83.6%。以热灭活嗜水气单胞菌刺激中华鳖后,经荧光定量PCR检测,在48h内,肝、脾和肾组织中MyD88 mRNA相对表达量均出现不同程度的增加,尤以脾脏中的增幅最为明显,为对照组的6.89倍;中华鳖心脏成纤维样细胞经20ng LPS刺激后1～8h,MyD88表达量有所提高,24h的表达量最高。该研究结果将为开展中华鳖天然免疫奠定良好基础。  

拟穴青蟹泛素基因的克隆及其在性腺发育过程中的表达

在实验室所构建的拟穴青蟹(Scylla paramamosain)EST文库基础上筛选出泛素基因(Ubquitin,Sp-Ub)片段,利用RACE技术克隆其全长cDNA序列,并对其结构进行分析;利用实时定量PCR技术检测该基因在雌蟹各组织及性腺不同发育阶段中的表达情况。结果显示,Sp-Ub基因全长555 bp,编码154个氨基酸,其第1~76个氨基酸为高度保守的泛素结构域,第101~147的氨基酸残基为典型的核糖体蛋白S27a的保守区域;预测的泛素结构域二级结构由5个延伸链,1个α-螺旋及其连接的无规卷曲构成,Sp Ub三维结构由1个α-螺旋以及5个β片层。多重比对表明不同物种的泛素结构域和核糖体蛋白S27a结构域在进化过程中高度保守。定量PCR结果显示,Sp-Ub在鳃中的表达水平最高,卵巢次之,各组织间的表达无显著性差异,说明Sp-Ub基因在各组织中的表达恒定,且具有普遍作用;在卵巢发育过程中,Sp-Ub在O5期的表达水平最高,O1、O4期次之,O2期表达量最低且与O5期具有显著差异(P<0.05);在精巢发育过程中,Sp-Ub在T2期的表达量最高,其次为T1期,T3期表达最低且与T2期具有显著差异(P<0.05)。本研究结果说明了Sp-Ub对拟穴青蟹生殖细胞的生长和发育可能具有重要作用。本研究将为甲壳动物性腺发育调控的分子机制奠定基础。  

罗非鱼湖病毒核蛋白的克隆表达、抗体制备及其组织分布

近年来罗非鱼湖病毒(TiLV)在多个国家流行，对世界罗非鱼养殖业造成严重威胁。中国是罗非鱼第一养殖大国，尽管我国大陆还没有TiLV的正式报道，鉴于吉富罗非鱼是我国重要的罗非鱼养殖品种，其对TiLV的感染特性研究具有重要意义。本实验采用TiLV对吉富罗非鱼进行人工感染，随后在肝脏组织中克隆和测定了TiLV第6片段基因。罗非鱼湖病毒第6片段基因cDNA全长1 044 bp，开放读码框(ORF)为954 bp，编码317个氨基酸，预测分子量为36.38 ku；5''非编码区(NCR)为19 bp，3''非编码区(NCR)为972 bp。系统进化树分析表明该蛋白属于TiLV核蛋白(NP)。随后在大肠杆菌中表达和提纯了GST融合NP蛋白，在新西兰大白兔上制备了多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价为1∶51 200，且抗体可特异性识别感染组织中的病毒NP蛋白。对吉富罗非鱼不同组织进行苏木精—伊红(H.E)染色观察，发现肝脏组织坏死并形成合胞体，脾脏部分细胞出现空泡、坏死，含铁血黄素增多，头肾细胞坏死，鳃丝上皮细胞明显解离脱落，鳃小片黏连，脑组织细胞肿大。通过蛋白印迹法(WB)和免疫组化(IHC)对人工感染TiLV的吉富罗非鱼不同组织进行检测，结果显示，NP蛋白在肝脏、脑、体肾和头肾等组织中均有表达，以肝脏组织中表达量最高。为了解吉富罗非鱼对TiLV的免疫反应，通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)测定免疫因子TNF-α和TGF-β在主要免疫器官脾脏和头肾组织中的表达。研究表明，在感染早期(感染后12~24 h)，病毒可显著抑制TNF-α和TGF-β在脾脏和头肾中的表达，可能通过抑制宿主这些免疫因子来促进病毒自身早期的复制。本研究将为进一步解读TiLV的致病机理及其高效防控提供理论基础。  

黄颡鱼FZD家族4个基因的克隆、组织表达及对铜的响应

实验采用RT-PCR和RACE克隆fzd2、fzd3a、fzd4和fzd10基因,其c DNA全长分别为2 176、3 243、2 509和3 021 bp,其中ORF长度分别为1 652、2 084、1 649和2 161 bp,编码551、695、550和586个氨基酸。氨基酸序列比对和系统树分析显示,4种基因十分保守,黄颡鱼与斑点叉尾鲖亲缘关系最近。组织表达分析显示,4种基因的m RNA在脑、脾脏、肾脏、鳃、心脏、肌肉、脂肪、肝脏及卵巢等组织中都有表达,而其表达量不尽相同。FZD家族基因对铜的响应研究表明,在暴露28 d时,fzd3a m RNA水平随着铜浓度的增加而增加,但是fzd2、fzd4和fzd10基因表达各个处理组无显著性差异;在56 d,fzd2m RNA水平在30μg Cu/L组最高,其他2个组差异不显著,fzd3a、fzd4和fzd10的基因表达在3个铜暴露组中均无显著差异,表明fzd家族这些基因的功能发生了分化,部分成员介导了铜影响黄颡鱼卵巢发育的调控。