磁珠富集法与小片段克隆法筛选鲤微卫星的比较研究

用2种方法克隆黑龙江鲤(Cyprinus(Cyprinus)carpio haonatopterus)的微卫星序列。这2种方法分别是：①经典的小片段DNA克隆库，用末端标记的[γ^-32]ATP的CA重复序列为探针筛选；②将酶切获得的小片段DNA用结合有磁珠的并连接有15个CA重复序列的生物素进行富集，获得的含有CA重复的DNA片段并经过两次PCR扩增再克隆的方法获得富集微卫星片段的克隆库。从前一个方法的克隆库中筛选2000个菌落，获得阳性克隆45个，有22个含有微卫星，完美型的占63．6％，非完美型的占22．7％，混合型的占13．7％，重复次数超过10的有9个，占40．9％；从方法②的克隆库中筛选2600个菌落，获得阳性克隆1300个，测序其中的390个克隆，微卫星314个，完美型的占79．0％；非完美型的占14．3％；混合型的占6．7％，重复次数超过10的有293个，占93．3％。结果表明，用生物素结合磁珠富集法克隆微卫星效率高，成本低，所获微卫星质量高，是一种值得推荐的微卫星制备方法。  

微卫星DNA标记对乌苏里江哲罗鱼遗传多样性的分析

从网上查询获得鳟微卫星标记30对，并对乌苏里江哲罗鱼的基因组进行遗传多样性分析，结果筛选出10对具多态性的微卫星标记。并用其中6对微卫星引物对17尾乌苏里江哲罗鱼进行基因组DNA扫描检测。用2％的琼脂糖凝胶电泳检测微卫星标记的PCR扩增产物，并对扩增结果进行了统计分析，计算了6个基因座的等位基因频率、杂合度等。结果表明，乌苏里江哲罗鱼等位基因频率为0．0455～0．7857，多态信息含量(PIC)为0．2801～0．6351，杂合度(H)为0．3368～0．6563。统计结果初步表明乌苏里江哲罗鱼的遗传多样性程度处于中等偏下水平。同时，结合资源量下降的事实，建议在保护遗传多样性的前提下对其采取人工繁殖和放流的方法增加其种群数量。  

鲫鱼4群体基因组DNA遗传多样性及亲缘关系的微卫星分析

采用微卫星技术，用9对微卫星引物对4个鲫鱼群体普通鲫鱼(C．auratus auratus)、红鲫(C．suratus red var)、白鲫(C．auratus cuvieri)和彭泽鲫(C．auratus auratus var．Pengze)的遗传多样性及亲缘关系进行研究。结果表明，4种鲫鱼的平均遗传杂合度值在0．607～0．721，其中自鲫0．721、红鲫0．652、彭泽鲫0．629、鲫鱼0．607；平均多态信息含量值在0．530～0．670，其中自鲫0．670、红鲫0．586、彭泽鲫0．549、鲫鱼0．530。由此可见，4个鲫鱼群体的遗传多样性总体水平较高，但白鲫的遗传多样性最高，鲫鱼的遗传多样性最低。在4种鲫鱼群体间，鲫鱼和白鲫群体间的遗传相似性指数最小(0．714)，遗传距离值最大(0．286)，说明这两种群体亲缘关系较远；白鲫与红鲫群体间遗传相似性指数最大(0．812)，遗传距离值最小(0．188)，这可推断白鲫与红鲫亲缘关系较近。聚类分析结果表明，白鲫和红鲫亲缘关系较近，而鲫鱼和彭泽鲫亲缘关系较近。研究鲫鱼遗传多样性对鲫鱼种质资源的保护和遗传改良具有重要意义。  

从中国对虾ESTs中筛选微卫星标记的研究

利用生物信息学方法在含有10446个中国对虾ESTs的数据库中进行微卫星序列的筛选，共发现微卫星序列229个，占整个ESTs数据库的2．19％，其中含双碱基重复序列146个和3碱基重复序列58个，分别占在ESTs数据库中发现微卫星序列总数的63．76％，和25．33％，大部分发现的微卫星序列均为Perfect形式的重复序列。根据筛选得到的微卫星序列设计并合成引物19对进行多态性检测，在有扩增产物的16对引物中，首次筛选得到8个中国对虾微卫星标记，并对这些微卫星标记进行了等位基因频率、观测杂合度、期望杂合度、PIC值等统计学指标的评价。结果表明，在8个微卫星位点上，等位基因的数目从5到15不等，等位基因长度从：165～305bp，期望杂合度和多态性信息含量分别为0．59到0．89和0．56到0．88，表明这8个中国对虾微卫星标记完全适合于遗传分析。  

哲罗鱼基因组微卫星富集文库的构建与分析

采用磁珠富集法构建哲罗鱼（Hucho taimen Pallas）荩因组微卫星文库。哲罗鱼基因组DNA经MboⅠ限制性内切酶消化后，选取400-900bp的片段，用生物素标记的简单重复序列（ACA）15作探针与其杂交，杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上，获得目的片段，连接T载体克隆，构建基因组微卫旱富集文库。再用同位素标记的（ACA）15探针进行二次筛选，筛选出686个阳性克隆，阳性克隆率为35．94％。对其中140个阳性克隆进行测序，共获得149个微卫星序列，4个小卫星序列，其GenBank Accession Number为DQ110955～DQ121108。其中perfect（完美型）62个，占41．61％；imperfect（非完美型）92个，占61．74％；compound（混合型）5个，占3．36％，重复次数主要分布于6～45（81．21％），平均重复次数为32．5，这表明（ACA／TGT）。在哲罗鱼基因组DNA中含最非常丰富。本研究旨为从DNA水平上研究哲岁鱼种群结构、遗传多样性及目前群体现状等方面提供有效工具。  

中国鲤几个代表种群基因组DNA遗传多样性分析

中国鲤具有悠久的养殖历史和重要的经济价值,无论是天然种群还是养殖品种,年产量远超过其它鱼类。近几十年来,养殖新品种的开发获得成功,大大提高了产量,改善了品质。但是由于盲目的开发利用,许多重要的鲤养殖种类的种质资源遭到破坏。"江西三红"(Cyprinuscarpiovar.xingguonensis、Cyprinuscarpiovar.wuyuanensis、Cyprinuscarpiovar.wananensis)、黄河鲤(Cyprinusycarpiovar.)和黑龙江野鲤(Cyprinuscarpiohaematopterus)是中国鲤几个具有代表性的养殖品种和野生种,在我国鲤鱼遗传育种研究中均占有非常重要的地位。应用第二代分子标记,即微卫星标记(microsatellite)84个,对以上5个具有代表性的中国鲤进行了全基因组DNA检测。结果表明,当退火温度提高至60℃时,有43对标记引物扩增出清晰的条带,其中有14对在群体间呈现多态性,扩增等位基因位点为2～4个。微卫星座位MFW4,MFW19,MFW23和MFW26在群体内显示了高度的多态性,扩增等位基因位点为7～13个。统计实验结果发现,"江西三红"3个品种间遗传差异较小,兴国红鲤和荷包红鲤的亲缘关系较近(0.93);属于同一亚种不同地理种群的黄河鲤和黑龙江野鲤具有较高的遗传相似性(0.89)。另外,根据微卫星多态性分析结果,探讨了这5种鲤的遗传多样性。  

鳙鱼微卫星分子标记的筛选

采用常规方法从鳙鱼(Aristichthys nobilis)血液中提取基因组DNA，经限制性内切酶Sau3AI酶切后，选取250～750bp大小的片段构建鳙鱼基因组文库。采用人工合成的重复序列(CA)15、(AG)12、(AAG)8用同位素标记作为探针，通过原位杂交筛选基因组文库，获得鳙鱼的微卫星序列。进一步用引物设计软件Primer Premier 5．0设计引物。通过杂交获得99个阳性克隆，经测序筛选出82个微卫星序列，设计引物65对。  

磁珠富集法分离草鱼微卫星分子标记

磁珠富集法是一种快速、高效的分离微卫星分子标记的方法。本研究通过该方法分离草鱼的微卫星分子标记。将草鱼（Ctenopharyngodon idella）基因组DNA经Sau3AI酶切，同收纯化400～900bp片段，连上接头，构建“基因组PCR文库”。用生物素标记的简单重复序列（CA）15作探针与其杂交，杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上，经一系列的洗涤过程，去除磁珠表面不含有微卫星的片段。将吸附在磁珠上的片段洗脱，PCR扩增放大，再进行克隆和测序，根据微卫星两端的保守序列设计引物，即可得到微卫星分子标记。本研究义通过同位素标记的探针（CA）15进行二次杂交筛选，获得阳性克隆132个，所得到的阳性克隆经测序，86．36％含有微卫星序列，共获得130个微卫星DNA序列。用引物设计软件Primer Premier5．0没计引物83对。  

剑尾鱼微卫星DNA的筛选

以剑尾鱼(Xiphophorus helleri)为材料,经MboⅠ限制性内切酶消化基因组DNA后,选取500～2 000 bp的片段连接到经BamHⅠ酶切的pUC18载体上,转化大肠杆菌DH5α构建部分基因组文库.采用设计合成的(AC)7、(GT)7重复序列为引物,PCR筛选部分基因组文库,对其中9个重组阳性克隆进行测序,结果共获得24个微卫星序列,其中Perfect(完美型)13个,占54.2%;Imperfect(非完美型)3个,占12.5%;Compound(混合型)8个,占33.3%.表明(AC/GT)n在剑尾鱼的基因组DNA中含量非常丰富.同时,根据其中3个克隆微卫星的侧翼序列设计引物,PCR扩增剑尾鱼基因组DNA,结果均扩增到目的片段.而且,这3对引物扩增出来的微卫星片段在非选育的剑尾鱼中显示出多态性,而在近交系19代则表现为单态,为剑尾鱼的实验动物化遗传研究提供了理论依据.  

5种鲟、鳇鱼基因组DNA遗传多样性分析

以史氏鲟(Acipenserschrencki)、达氏鳇(Husodauricus)俄罗斯鲟(A.gueldenstaedti)、小体鲟(A.ruthenus)西伯利亚鲟(A.baeri)的基因组DNA为实验材料,用改进的DNA提取方法获得了完整的基因组DNA片段。通过25个SSLP及Ⅰ型引物对5种鲟鳇鱼的基因组DNA进行PCR多态性引物筛选,获得11个能扩增出遗传多态性的有效引物,通过对5种鱼的PCR分析,平均遗传距离为0.748,遗传距离最大的为达氏鳇和小体鲟之间为0.9355,DNA分析结果还显示,鲟鳇鱼的遗传多样性程度十分低下(47.93%)。同时建立了5种鲟鳇鱼的聚类图。