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1.
LRR-RLK是类受体蛋白激酶RLK家族中最大的亚家族,在调控植物非生物胁迫等方面具有重要作用。为解析水稻LRR-RLK成员LP7(LOC_Os05g24010)在耐低磷胁迫中的作用,从水稻品种日本晴中克隆了LP7全长序列,分析其编码蛋白的氨基酸序列,研究其组织表达模式、亚细胞定位及低磷胁迫下的表达变化。结果表明,LP7基因全长2 832 bp,编码943个氨基酸,LP7蛋白具有典型的LRR-RLK成员特征,LP7蛋白与玉米中的同源蛋白NP_001131018同源性比较高,同源性高达77%。组织表达模式分析表明,LP7基因在根、茎、叶等组织中均表达,在叶中表达量最高。亚细胞定位结果表明,LP7蛋白定位于细胞膜上。实时荧光定量PCR分析表明,LP7基因受低磷胁迫诱导表达,其表达量较正常培养条件下增加15倍。初步推测该基因可能在水稻响应低磷胁迫中具有重要作用。 相似文献
2.
类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBLs)互作蛋白(CIPKs) 作为类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物响应非生物胁迫信号转导中起着重要作用。基于前期山葡萄响应低温胁迫转录组测序结果,发现低温胁迫引发的早期伤害及感知阶段的激酶基因中涉及CBL-CIPK 信号通路的VaCIPK18表达显著上调。为进一步研究山葡萄(Vitis amurensis)VaCIPK18激酶参与低温胁迫的功能,采用同源克隆获得了VaCIPK18基因,其开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。基于对VaCIPK18蛋白生物信息学分析,获取胞外结构域中抗原表位丰富的肽段,并将其C端调控结构域(230~439 aa)构建到原核表达载体pET28a-SUMO。将重组表达载体转化至大肠杆菌(E. coli Rosetta)中,经0.8 mmol·L-1 IPTG、37℃诱导4 h表达出大小为42 kDa的包涵体蛋白。将重组蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得anti-VaCIPK18多克隆抗体,经检测具有高效价及特异性。Western Blot结果表明,该抗体可以与葡萄内源CIPK18特异性结合,且在50 kDa位置出现与预期一致的条带。同时,CIPK18在低温胁迫后葡萄叶片中蛋白表达水平与室温下相一致,但两种状态下均存在可能的磷酸化与泛素化修饰现象。本研究结果为进一步探究VaCIPK18的蛋白定位、表达及其功能奠定了基础。 相似文献
3.
4.
【目的】通过同源重组敲除技术,解析菌丝型大丽轮枝菌中蛋白激酶A催化亚基基因VdPKAC1在调控微菌核发育、产孢及其致病力方面的作用。【方法】利用Invitrogen公司的Gateway®技术构建VdPKAC1的同源重组敲除质粒。该质粒的潮霉素抗性基因盒两端分别为靶标基因5′和3′端各1 kb的DNA序列。通过农杆菌AGL-1的介导,将该质粒的T-DNA区域整合到来源于棉花的菌丝型大丽轮枝菌V07DF2菌株中。从6个随机选择的含有潮霉素抗性基因片段的转化子中,通过靶标基因的PCR检测,获得了5个VdPKAC1基因敲除突变体。经过Southern杂交检测,选择了3个敲除突变体材料(2B5、C5和HH2)进行突变表型的观察和分析。在液体PDB培养7 d后观察敲除突变体与野生型菌株的黑色素产生情况;在固体PDA培养28 d后,观察敲除突变体与野生菌株的菌丝生长和休眠结构形成情况。此外,利用棉花根提取物对液体Cazpek-Dox培养7 d的各菌株分别进行诱导处理,在处理24、72 h后分别统计分生孢子数量,以此对敲除突变体和野生菌株的分生孢子产生能力进行评估。最后,将孢子浓度为1×107个/mL的突变体和野生菌株的分生孢子液灌根接种2叶期的棉花,测定其致病力。【结果】Southern杂交结果表明,在上述5个敲除突变体中,只有2B5和C5两个菌株为T-DNA单拷贝插入,而其他菌株均存在T-DNA异位整合的情况。在PDA培养条件下,3个敲除突变体(2B5、C5和HH2)与野生型相比具有黑色素合成增加,气生菌丝更加发达的特点。其中,敲除突变体2B5和C5在平板培养条件下还形成了野生型菌株没有的、与典型微菌核形态不同的深褐色“链状休眠菌丝体结构”。在棉花根提取物的诱导处理下,3个敲除突变体产生的分生孢子数量少于野生型菌株。另外,致病力分析结果表明,敲除突变体材料仍然具有一定的致病力,但却显著弱于野生菌株V07DF2。【结论】在大丽轮枝菌中,通过蛋白激酶A介导的环腺苷酸信号途径控制多种重要性状,而VdPKAC1是这一途径中的重要成员。以前的报道证实,VdPKAC1负调控微菌核的数量,而本研究利用菌丝型菌株V07DF2在PDA培养基上不产生微菌核的这一特性,通过同源重组原理敲除该负调控基因,成功获得可以在PDA上产生休眠结构的菌丝型大丽轮枝菌菌株的突变体。这些突变体材料将为大丽轮枝菌微菌核发育信号途径及其调控基因的发掘提供平台和基础。 相似文献
5.
在构建玉米蔗糖非酵解型蛋白激酶2(SnRK2)基因家族表达载体的过程中,因为表达载体可供选择的多克隆位点较少,且有些还与目的基因同源,所以采用转移PCR(T-PCR)扩增技术替代通常的酶切连接方法。为避免错误连接或未连接的第一轮T-PCR中间产物对退火温度不同的第二轮扩增循环产生干扰,本研究对T-PCR接头引物3'-端和5'-端的两段序列及其退火温度、引物、供体质粒和目标质粒模板的浓度,特别是温度循环程序进行设计和筛选,并用扩增构建的重组载体转化大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆,进行菌液PCR和测序验证。结果表明,在两条引物3'-端序列理论退火温度相差不大的情况下,T-PCR第一轮扩增的退火温度以低于或接近其中较低的理论退火温度为宜。但在两条引物3'-端序列理论退火温度相差较大的情况下,则应高于其中较低的理论退火温度。T-PCR第二轮扩增的退火温度,适当低于两条引物理论退火温度的平均值。按优化的温度循环程序,从供体质粒pMD19-T扩增ZmSnRK2基因家族8个成员的编码序列,并整合到目标载体pHBT95启动子下游特异位点,重组率达60%以上。综上表明,T-PCR对没有适用多克隆位点的载体构建的实用性较强。本研究通过优化的温度循环程序为表达或诱变载体构建提供了一定的理论参考。 相似文献
6.
7.
【目的】筛选玉米蔗糖非酵解型蛋白激酶2(Sucrose non-fermenting protein kinase 2,SnRK2)的底物蛋白,鉴定其在玉米脱落酸(Abscisic acid,ABA)信号转导中的作用,为进一步解析玉米中ABA介导的非生物逆境抗性机制提供参考。【方法】根据前期研究结果,通过与拟南芥SnRK2已知底物蛋白的序列比对和保守基序分析,从磷酸化水平响应ABA诱导且上调的238个蛋白中预测ZmSnRK2作用的底物蛋白,用酵母双杂交试验验证ZmSnRK2家族成员与候选蛋白的相互作用,分析其在玉米ABA信号转导中的作用。【结果】从前期鉴定的玉米磷酸化水平响应ABA诱导且上调的238个蛋白中,预测出10个ZmSnRK2候选底物蛋白,实际扩增出其中8个蛋白的编码基因以及10个ZmSnRK2基因家族成员。酵母双杂交试验结果表明,GenBank序列号为XP_008666965.1、NP_001142137.1和XP_008656995.1的候选底物蛋白,因自体磷酸化不能用酵母双杂交检测,GenBank序列号为NP_001183680.1的候选底物蛋白可以与ZmSnRK2.1、2.2、2.4、2.5、2.7、2.8、2.10、2.11蛋白相互作用,GenBank序列号为NP_001145831.1和NP_001167942.1的候选底物蛋白分别可以与ZmSnRK2.1和ZmSnRK2.10蛋白相互作用。【结论】NP_001183680.1和NP_001167942.1蛋白是ZmSnRK2家族部分成员的磷酸化底物,是玉米ABA信号转导途径的下游组分;NP_001183680.1蛋白与拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶同源,NP_001167942.1蛋白为包含SAM结构域的蛋白,这2个蛋白均涉及许多生理生化过程,说明ZmSnRK2下游的ABA信号转导呈发散状。 相似文献
8.
为挖掘花生抗逆相关基因,本研究以花生品种花育20号为试验材料,根据cDNA文库中已知的促丝裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)基因EST序列设计引物,通过RACE-PCR克隆得到AhMKK4基因。结果表明,AhMKK4基因序列全长1 434 bp,含有3'非编码区151 bp,5'非编码区317 bp,开放阅读框全长966 bp,编码一条含有322个氨基酸的蛋白序列。预测其分子量为36.74 kDa,属于MAPKK基因家族D组成员。亚细胞定位显示AhMKK4基因定位于细胞质和细胞核中。RT-qPCR分析发现,AhMKK4基因在根中表达量高于其他组织,说明该基因具有组织表达特异性;AhMKK4基因受JA和IAA诱导时表达量上调,受SA和ABA诱导时表达量下调,说明该基因可能参与到JA和IAA介导的信号转导途径;AhMKK4在盐胁迫下表达量上调,说明该基因可能参与花生对盐胁迫的适应性调控。本研究结果为花生抗逆育种研究提供了新的基因资源。 相似文献
9.
为了解不同类受体蛋白激酶RLKs激酶域响应病原相关分子PAMPs信号强度的差异,本研究将拟南芥FLS2的胞外域(NT)与6种不同RLKs的激酶域(KD)组合为重组RLKs(rRLKs),构建融合基因表达载体,并通过拟南芥原生质体瞬时表达的方法,将rRLKs/FLS2、35S::GUS(内参)和FRK1::Luciferase(响应报告载体)共转化到拟南芥fls2突变体叶肉原生质体细胞中;后经flg22处理后,通过对萤光素酶(Luciferase)和葡糖苷酸酶(GUS)活性的定量分析和比较,鉴定不同RLKs激酶区域信号传导的强度。结果表明:1)FLS2、EFR、PEPR1和RLK7的激酶域可明显激活抗病响应报告基因FRK1的表达,对植物抗病反应起正调控作用;FLS2和EFR的激酶域信号传导能力最强,两者无显著差异(P0.05);PEPR1和RLK7激酶域的信号传导能力稍弱,其信号传导强度分别是FLS2的57.13%和32.92%,与FLS2差异显著(P0.05);2)CERK1和NIK1的激酶域对FRK1的上调作用不明显,其信号传导强度分别仅有FLS2的9.76%和7.88%,和FLS2NT(对照)之间无显著差异(P0.05);3)PSKR1激酶域引起FRK1表达下调,对PTI起负调控作用。本研究结果有助于了解RLK家族的抗病响应作用机理,并为人工构建更高效的rRLK蛋白提供参考。 相似文献
10.