日本鳗鲡Ⅱ型干扰素基因(IFN-γ和IFN-γrel)的原核表达与纯化研究

分别以日本鳗鲡(Anguilla japonica)pMD19-T-IFNγ和pMD19-T-IFN-γrel重组克隆质粒为模板,采用PCR方法扩增日本鳗鲡IFN-γ和IFN-γrel基因,而后分别将IFN-γ和IFN-γrel成熟肽的编码序列克隆至原核表达载体pQE30和pET32a上,成功构建了重组表达载体pQE30-IFN-γ和pET32a-IFN-γrel。将重组表达载体pQE30-IFN-γ和pET32a-IFN-γrel分别转化入Escherichia coli M15和Escherichia coli BL21感受态细胞进行表达,并优化IPTG诱导表达体系后用SDS-PAGE电泳鉴定IFN-γ与IFN-γrel重组蛋白表达形式。IFN-γ与IFN-γrel重组蛋白经镍柱纯化后进行SDS-PAGE电泳检测和Western blot鉴定。结果显示,重组表达载体pQE30-IFN-γ与pET32a-IFN-γrel分别在E.coli M15和E.coli BL21中得以正确表达。重组IFN-γ蛋白分子量为21 kD左右,表达的融合蛋白以可溶性形式存在;重组IFN-γrel蛋白分子量为31 kD左右,以包涵体形式存在。且两者均在1.0 mmol·L~(-1) IPTG诱导6 h时表达量最高。经镍柱纯化和Western blot检测,成功获得高纯度的IFN-γ和IFN-γrel重组蛋白。建立了日本鳗鲡IFN-γ和IFN-γrel基因的原核表达系统,为进一步研究日本鳗鲡干扰素系统的功能及调控机制奠定了基础。     

“百草霜”对大刺鳅生长及其酶活性的影响

研究旨在考察饲料中添加不同水平的"百草霜"对大刺鳅生长、消化酶及非特异免疫活性的影响。将野生大刺鳅子一代(Mastacembelus aculeatus)幼鱼随机分成4组,每组3个平行,其中1组为饲喂鳗鲡配合饲料的对照组,另外3组分别为饲喂添加0.1%、0.5%、1.0%"百草霜"鳗鲡配合饲料的试验组,水温26~28℃,溶解氧5.0~6.0 mg/L,pH 6.5~7.5,饲养周期为56天。结果表明:与对照组相比,添加0.5%"百草霜"对大刺鳅增重率和特定生长率分别提高了24.76%和16.18%(P0.05),而0.1%组饲料系数降低了30.23%(P0.05)。添加"百草霜"未影响大刺鳅成活率(P0.05)。胃蛋白酶在0.5%组最高(P0.05);肠道及肝脏淀粉酶活力随着"百草霜"浓度的增大均呈先上升后下降的趋势,其中0.1%组效果最好,与对照组差异显著(P0.05)。非特异性免疫指标的测定结果显示:添加0.1%和0.5%的大刺鳅肠道超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)的活性显著高于对照组(P0.05),而肝脏过氧化氢酶活性在0.1%组达到最大(P0.05),各组肝脏SOD、AKP、ACP与对照组无显著差异(P0.05)。上述研究表明,饲料中添加剂量为0.1%~0.5%的"百草霜"能显著提高大刺鳅酶活性,满足生长需求。     

sodA、sodB和KatG在嗜水气单胞菌抗氧化胁迫中的协同作用

以嗜水气单胞菌野生株B11和基因稳定沉默株sodA-RNAi、sodB-RNAi和KatGRNAi为研究对象,比较野生株和沉默株在不同氧化胁迫条件下sodA,sodB和KatG表达的相关性及与细菌生长和存活的相关性,以探讨抗氧化胁迫基因在细菌抵御氧化胁迫过程中的作用和机制。结果显示,无氧化胁迫条件下sodA、sodB和KatG中任何一个基因被沉默后,其余两个基因的表达均受到显著抑制,说明这些抗氧化胁迫基因在表达上密切相关。在外源H2O2胁迫下,sodA、sodB和KatG中任何一个基因被沉默后,其他两个抗氧化胁迫基因的表达均表现为显著上调;在甲基紫晶(MV)诱导的内源性活性氧(ROS)胁迫下,各沉默株中sodA或sodB的表达水平总体表达为上调,但是在KatG的表达却呈现下调,说明sods的表达在细菌抵御内源性ROS的损伤中更具重要性。在H_2O_2胁迫下,随着H_2O_2浓度的增加,野生株B11的存活率仍然保持在较高的水平,而沉默株sodA-RNAi、sodB-RNAi和KatG-RNAi的存活率则显著降低;此外,菌株生长曲线显示,sodA、sodB和KatG的表达可影响嗜水气单胞菌生长曲线延滞期的长短。在不同浓度MV诱导的ROS胁迫下,野生株B11和沉默株KatG-RNAi的存活率仍然保持在较高的水平,沉默株sodA-RNAi和sodB-RNAi的存活率则显著降低,但4株菌仍然能保持一定的生长能力。研究表明,在不同氧化胁迫条件下,细菌可通过不同抗氧化胁迫基因的协同作用,共同抵御ROS的损伤,在H_2O_2的胁迫下,KatG对嗜水气单胞菌的生存更为重要,而在MV诱导的内源性ROS胁迫下,sod的表达对嗜水气单胞菌生存的贡献更为突出。     

镧对稀有鮈鲫肝胰脏抗氧化酶活性及MDA含量的影响

以氯化镧(LaCl3?7H2O）为试验毒物，以稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）为试验材料，采用21 d慢性毒性试验（La3+含量分别为0.00、0.04、0.08、0.16、0.32、0.80 mg/L），通过检测稀有鮈鲫肝胰脏中超氧物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量,研究了镧暴露胁迫对水生动物抗氧化系统的影响，以期从抗氧化生理响应的角度探讨稀土元素镧对水生动物的毒理机理。结果显示，与对照组相比，0.04～0.32 mg/L试验组肝胰脏SOD活性出现一定程度降低(P＞0.05),但0.80 mg/L组SOD活性出现一定程度上升(P＞0.05)；0.04～0.32 mg/L试验组肝胰脏CAT活性较对照组出现一定程度降低(P＞0.05),但0.80 mg/L组CAT活性出现一定程度上升(P＞0.05),且0.80 mg/L组CAT活性显著高于0.04～0.32 mg/L组(P＜0.05)；0.04～0.16 mg/L试验组肝胰脏MDA含量较对照组出现一定程度降低(P＞0.05),0.32mg/L组MDA含量略微升高(P＞0.05),0.80 mg/L组MDA含量显著高于对照组(P＜0.05)，也显著高于其它La3+暴露组(P＜0.05)。研究表明，一定浓度的La3+暴露胁迫会对环境中水生生物抗氧化系统产生不利影响。     

鱼用功能性卵黄粉对鳗鲡的免疫保护和生长性能的影响

嗜水气单胞菌对水产动物养殖具有极大的危害。前期研究已制备抗嗜水气单胞菌外膜蛋白(MOMP)的鱼用功能性卵黄粉。本文通过ELISA和Western blot分析该功能性卵黄粉所含抗体的效价和特异性,结合对鳗鲡的免疫攻毒保护和投喂后的生长性能测定,研究其对防控鳗鲡嗜水气单胞菌疾病的影响。结果显示,鱼用功能性卵黄粉中的卵黄抗体能与3株代表菌的MOMP抗原特异结合,ELISA效价检测显示效价均达到1.10 240以上;投喂鱼用功能性卵黄粉13 d后,鳗鲡经嗜水气单胞菌攻毒的存活率较未投喂组提高30.8%。3个养殖场进行的鳗鲡生长性能测定结果显示,饲料中添加0.3%的鱼用功能性卵黄粉后,鳗鲡的增重率较对照组分别提高42.8%、13.6%和8.8%,饲料转化率分别提高4.04%、3.11%和2.55%;死亡率数据统计显示,2个养殖场差别不明显,1个养殖场死亡率下降了38.8%。上述结果说明,鱼用功能性卵黄粉可用于嗜水气单胞菌感染引起的鳗鲡疾病的预防和控制,具有进一步的研究和开发的前景。     

配合饲料在不同密度大刺鳅精养模式中的应用效果

旨在考察不同养殖密度对大刺鳅生长性能和摄食行为的影响。采用310天的单因素水泥池精养试验对初始密度为657.52 g/m³（A组）、1177.27 g/m³（B组）两组大刺鳅的生长性能及特征进行比较。结果表明：大刺鳅的生长性能与养殖密度呈负相关,其中A组大刺鳅的增重率、特定生长率、肥满度及存活率均高于B组,而饲料系数及单位面积产量分别比B组低13.82%与30.77%。各密度组大刺鳅的体长均与体质量呈幂函数相关（A组：W=0.0028L^3.041;B组：W=0.0049L^2.953）,为等速生长。体长、体质量与养殖天数呈多次函数相关（A组：L=-8×10^-5d²+0.07758d+13.059,W=-2×10^-6d³+0.0011d²+0.1369d+7.2355;B组：L=-6×10^-5d²+0.062d+12.379,W=-2×10^-6d³+0.001d²+0.1031dd+6.8031）。该试验条件适合于大刺鳅的规模化生产,今后应进一步细化大刺鳅的养殖密度,寻找最佳产量与饲料利用之间的关系,争取最大效益。     

大刺鳅幼鱼配合饲料中适宜蛋白质、蛋氨酸和脂肪水平研究

为确定大刺鳅(Mastacembelus aculeatus)幼鱼配合饲料中蛋白质水平(Protein content)、蛋氨酸(Methionine content)和脂肪(Fat content)含量水平,优化大刺鳅幼鱼饲料配方,采用正交表L_9(3~4)设计,以蛋白质、蛋氨酸及脂肪为因素,设置3个水平,探讨不同水平组合对大刺鳅幼鱼生长性能及形态学指标的影响。结果表明,三种配合饲料营养成分对大刺鳅幼鱼生长性能有显著影响(P0.05),而对形态学指标影响不显著(P0.05)。蛋白质含量50%、蛋氨酸含量1.7%、脂肪含量4%时,大刺鳅幼鱼的增重率、特定生长率、蛋白质效率分别为177.38%、1.65%、2.65%,除与蛋白质含量50%、蛋氨酸含量2.0%、脂肪含量8%处理组差异不显著外(P0.05),与其余各组差异显著(P0.05)。蛋白质含量50%、蛋氨酸含量2.0%、脂肪含量8%时,饵料系数最低,达0.92。以增重率及饵料系数为考察指标,通过对实验结果的直观分析、层次分析和方差分析显示,各因素对正交试验的指标值影响的主次顺序为蛋白质水平蛋氨酸脂肪,大刺鳅幼鱼配方饲料蛋白质、蛋氨酸及脂肪最佳配比为50%、1.7%、8%。     

养殖密度对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长品质和生化指标的影响

为探讨养殖密度对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长性能、肌肉成分、血液生理生化指标的影响,选用初始体重为(25.23±0.09)g的瓦氏黄颡鱼幼鱼,分别设置G1、G2、G3、G4试验组,养殖密度分别为0.50、1.01、1.51、2.02kg·m~(-3)(即20、40、60、80尾·m~(-3)),在循环水养殖系统中进行60d的养殖试验。结果表明,幼鱼的终末体长、终末体重、特定生长率、肥满度随养殖密度增大而下降,饲料系数则呈上升趋势;G1组瓦氏黄颡鱼幼鱼终末体长、终末体重、特定生长率、肥满度、存活率显著高于G3组和G4组(P0.05),但G1、G2组鱼体肥满度、饲料系数及存活率无显著差异(P0.05)。肌肉中蛋白质含量随养殖密度增加而上升,脂肪含量则呈下降趋势,G1组瓦氏黄颡鱼肌肉蛋白质含量显著低于其他处理组(P0.05),脂肪含量显著高于其他处理组(P0.05)。血液白蛋白、溶菌酶水平随养殖密度增高呈下降趋势(P0.05),G1组显著高于G3、G4组(P0.05);谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平随养殖密度增高呈升高趋势(P0.05),G1、G2组显著低于G3、G4组(P0.05);在试验条件下,养殖密度对鱼体抗氧化能力影响不显著(P0.05)。综合分析,在本试验条件下,体质量为(25.23±0.09)g的瓦氏黄颡鱼适宜放养密度约为1.01kg·m~(-3),该结果可为工厂化养殖提供参考依据。     

饲料蛋白质水平对大刺鳅幼鱼生长性能、消化酶和肝转氨酶活性的影响

采用60 d的单因素饲养试验,探讨饲料蛋白质水平分别为35%、38%、41%、44%、47%、50%、53%对体质量为(5.21±0.15)g的大刺鳅(Mastacembelus aculeatus)幼鱼生长性能、消化酶和肝转氨酶活性的影响,以探明大刺鳅幼鱼配合饲料适宜蛋白质水平。试验结果表明:饲料蛋白质水平对大刺鳅幼鱼存活率的影响不显著(P>0.05)。与35%~38%蛋白质组相比,当饲料蛋白质水平为50%时,大刺鳅幼鱼增重率、特定生长率和蛋白质效率获得最大值,饲料系数获得最小值,分别为116.7%、1.55%/d、203.29%和0.99,差异显著(P<0.05)。随蛋白质水平升高,大刺鳅幼鱼胃蛋白酶、肠道胰蛋白酶及淀粉酶呈先上升后平稳趋势,50%蛋白质组的酶活性最高,为14.49、4 374.67 U/mg prot.和1.02 U/mg prot.。肝脏胰蛋白酶及淀粉酶活性分别在50%、53%蛋白质组达到最高,与35%~41%蛋白质组显著差异(P<0.05),谷丙转氨酶及谷草转氨酶均随饲料蛋白质水平的增加而升高,表明大刺鳅幼鱼体内蛋白质代谢活力随饲料蛋白质水平升高而增强,鱼体对蛋白质及氨基酸的利用率有一定提高。通过饲料中蛋白质含量与生长速率指标的回归分析,大刺鳅幼鱼饲料蛋白质的适宜含量为50.7%~52.5%。