传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙病毒和鳜弹状病毒三重PCR检测方法的建立

【目的】建立可同时检测传染性脾肾坏死病毒（infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV）、鳜鱼蛙病毒（Siniperca chuatsi ranairidovirus,SCRIV）和鳜弹状病毒（Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV）的三重PCR检测方法,为鳜鱼等养殖品种流行病学调查提供方法支撑。【方法】根据ISKNV MCP基因、SCRIV MCP基因和SCRV N基因设计3对特异性引物,对PCR扩增反应中的退火温度和引物用量进行优化,建立可同时检测 ISKNV、SCRIV和SCRV的三重PCR方法。为验证该方法的敏感性和特异性(备测病毒为IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、TiLV和SVCV),对22份疑似感染ISKNV、SCRIV和SCRV的样品分别进行单一和三重PCR检测。【结果】成功建立了三重PCR检测方法,利用该方法可同时检测ISKNV、SCRIV和SCRV,特异性较好,对IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、TiLV、SVCV等无扩增;该方法敏感性好,对3种病毒核酸的检测下限均为0.01 ng/μL;利用该方法和3种病毒单一PCR方法同时对22份临床样品进行检测,结果显示2种方法吻合率为100%,其中ISKNV阳性率为27%、SCRIV 阳性率为41%、SCRV阳性率为9%、ISKNV和SCRIV混合感染阳性率均为9%,无ISKNV、SCRIV和SCRV混合感染。【结论】建立的三重PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高等特点,可对这3种病毒进行快速鉴别诊断。     

罗非鱼不同养殖阶段喹诺酮类耐药菌群数量与组成分析

[目的]评估不同养殖阶段罗非鱼肠道及养殖环境中喹诺酮类耐药菌产生的风险,筛选出水产养殖耐药性监测指示菌,为建立科学的水产品耐药防控技术提供参考依据.[方法]选取萘啶酸(第一代)和恩诺沙星(第三代)2种喹诺酮类药物,通过平板计数法统计不同养殖阶段(苗种阶段、中间阶段及上市阶段)罗非鱼肠道及养殖环境(池塘水和底泥)中喹诺酮类耐药菌的数量及耐药率,然后采用高通量测序分析不同养殖阶段喹诺酮类耐药菌群的结构特征及组成变化.[结果]在不同养殖阶段罗非鱼肠道及其养殖环境中的细菌总数相对稳定,罗非鱼肠道的细菌总数维持在4.6×105~1.6×106 CFU/g,池塘水的细菌总数维持在5.2×103~2.1×104 CFU/g,池塘底泥的细菌总数维持在4.8×103~3.2×104 CFU/g.苗种阶段罗非鱼肠道菌群对萘啶酸和恩诺沙星的耐药率均高于中间阶段和上市阶段,分别为34.7%和19.0%.各养殖阶段的罗非鱼肠道及养殖环境优势菌群均以气单胞菌属、埃希菌—志贺氏菌属、鲸杆菌属、邻单胞菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属细菌为主.随着养殖阶段的推移,罗非鱼肠道中的气单胞菌属相对丰度呈下降趋势,而鲸杆菌属呈上升趋势;而养殖环境中的菌群结构无明显规律性变化.在罗非鱼肠道及养殖环境喹诺酮类耐药菌群中,埃希菌—志贺氏菌属和气单胞菌属的相对丰度较高,且随着养殖阶段的推移呈不同程度上升趋势.[结论]罗非鱼养殖的耐药风险主要集中在养殖前期阶段,埃希菌属和气单胞菌属是喹诺酮类耐药的主要菌群,应加强不同养殖阶段的饲养管理,减少病害发生以减轻抗菌药物使用带来的风险.此外,可选用埃希菌属和气单胞菌属作为水产养殖细菌耐药性监测的指示菌,实时监控喹诺酮类药物耐药性的产生与传播.     

鳜弹状病毒与传染性脾肾坏死病毒双重PCR检测方法的建立

【目的】建立鳜弹状病毒(SCRV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的双重PCR检测方法。【方法】分别针对SCRV N基因和ISKNV MCP基因的保守区域设计特异性引物,通过优化退火温度和引物用量(μL)比,建立SCRV和ISKNV的双重PCR检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行检验。应用建立的双重PCR方法对20份临床样品进行单一和双重PCR检测,比较单一和双重PCR的检测结果。【结果】成功建立了SCRV和ISKNV双重PCR方法,该法特异性较强,对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)等鱼类常见病毒无扩增;敏感性较好,对2种病毒DNA的检测下限均为0.01 ng/μL。20份临床样品的双重PCR样品检测结果显示,3份为SCRV阳性,11份为ISKNV阳性,2份为SCRV和ISKNV混合感染,结果与单一PCR检测结果一致。【结论】建立的SCRV和ISKNV双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较好,可用于鳜鱼SCRV与ISKNV的快速鉴别诊断和分子流行病学调查。     

厚朴酚对斑马鱼(Danio rerio)的急性毒性病理损伤评估

【目的】针对和厚朴酚(Honokiol)对斑马鱼(Danio rerio)的毒性损伤,采用半静态急性毒性实验将斑马鱼浸泡于和厚朴酚溶液中,研究和厚朴酚对斑马鱼的毒性作用及组织病理学影响。【方法】将105尾健康斑马鱼随机浸泡于7个试验组中(n=15):对照组(曝气自来水)、助溶剂乙醇组(1%体积比)和5个和厚朴酚浓度组(0.1、0.2、0.4、0.6、和0.8 mg/L),对斑马鱼的临床症状、大体病变、死亡率以及组织病理学进行判定,并结合组织病理评分系统评价各组斑马鱼的损伤情况,评估和厚朴酚的毒性。【结果】不同浓度和厚朴酚组浸泡的斑马鱼在96 h内出现不同程度死亡,其96 h半数致死浓度(LC_(50))为(0.530±0.014)mg/L,72 h-LC_(50)为(0.679±0.013)mg/L,48 h-LC_(50)为(0.758±0.012)mg/L,24 h-LC_(50)为(0.816±0.01)mg/L,而安全浓度(SC)为(0.264±0.003)mg/L。此外,在设定的浓度范围内,和厚朴酚未造成斑马鱼出现明显的临床及大体病理变化。组织病理学显示,和厚朴酚浸泡后主要导致鳃和脑充血,此外还可见鳃呼吸上皮坏死等,其余组织与对照组相比无明显病变。【结论】和厚朴酚对于斑马鱼存在一定毒性,鳃和脑可能是和厚朴酚对鱼类的主要毒性靶器官。     

加州鲈源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及耐药性分析

【目的】明确引起佛山市三水某水产种苗有限公司育种基地加州鲈（Micropterus salmonoides）体表出血和溃烂的病原菌,并进行药物敏感性分析,为该病的临床诊断及科学防控提供科学依据。【方法】采用常规细菌分离方法从患病加州鲈的肝脏、脾脏和肾脏等组织中分离病原菌,经革兰氏染色和磷钨酸负染后,使用光学显微镜和透射电子显微镜观察菌体形态及其染色特性;通过ATB Expression生化鉴定仪和Biolog微生物自动鉴定系统进行生理生化特性鉴定,基于16S rRNA序列和gyrB基因序列进行分子生物学鉴定,经人工回归感染试验和组织病理学观察进一步确定病原菌的致病性及其对组织细胞的损伤,同时以K-B纸片扩散法测定其药敏特性。【结果】从患病加州鲈肝脏中分离获得1株优势菌株（180803bj_jzl）,为周鞭毛的革兰氏阴性杆菌,Biolog微生物系统自动鉴定其为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）的可能性高达99.4%;基于16S rRNA序列和gyrB基因序列相似性构建的系统发育进化树均显示,分离菌株180803bj_jzl与弗氏柠檬酸杆菌聚类为一支,与GenBank已公布弗氏柠檬酸杆菌参考菌株的16S rRNA序列相似性均在99.00%以上,gyrB基因序列相似性则在91.00%以上。人工回归感染7 d内的累积死亡率达60%,临床症状与自然发病加州鲈的症状基本相同;其肝脏组织中央静脉和肝窦有红细胞淤积,肝细胞质内有大量空泡,呈散在变性坏死;脾脏的白髓与红髓分界不清,脾窦和脾小血管内有嗜铁血红素中心;鳃小片上皮细胞与毛细血管分离,呈球拍状,部分上皮细胞坏死脱落,只残存少量鳃小片骨架。分离菌株180803bj_jzl对氟罗沙星、氧氟沙星、大观霉素、新霉素、庆大霉素、恩诺沙星和诺氟沙星等7种抗菌药物敏感,对多西环素、四环素、乙酰螺旋霉素、罗红霉素、头孢氨苄和阿莫西林等15种抗菌药物已产生耐药性。【结论】弗氏柠檬酸杆菌感染可引起加州鲈体表出血和溃疡,且具有较强的毒力,致使肝脏、脾脏和鳃等组织病理损伤,实际生产中可选用新霉素和恩诺沙星等渔用抗菌药物进行防治。     

银离子对几种细菌的杀菌效应

由抗生素导致的耐药性问题日益严重,因此新型抗菌药物的研发迫在眉睫。银离子因具有抗菌作用,以及安全、无耐药性、稳定性高等优点而备受关注。为了探究银离子的抗菌机制,本实验选择几种常见水生细菌,研究其对银离子的耐受性和细菌种内、种间的"僵尸效应"(被银离子杀死的细菌可以杀死其他新鲜的细菌),以进一步明确银离子长效杀菌的机理。结果显示,银离子对5种细菌都表现出了明显的生长抑制。同种细菌和异种细菌之间都表现出明显的"僵尸效应",并且随着银离子浓度的提高,"僵尸效应"的效果越明显。为进一步研究银离子杀菌机制,通过透射电镜观察银离子处理后的嗜水气单胞菌和无乳链球菌,结果显示银离子处理后的细菌出现胞质皱缩,细胞膜呈弥散状态,甚至破裂,细胞内容物外流,最终致使细菌死亡。研究表明,银离子对5种细菌都有明显的生长抑制效应,并发现细菌之间存在"僵尸效应",可为研发新型的抗菌药物提供参考。     

草鱼肾中性粒细胞的分离鉴定与活性检测

分离纯化草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾中性粒细胞、鉴定和检测其活性, 目的在于为研究中性粒细胞的功能和免疫防御机制提供细胞材料。本研究使用鱼类脏器组织中性粒细胞分离试剂盒和差异贴壁法分离获得草鱼肾中性粒细胞; 应用迪夫氏染色、碘化钾-吡啰红 G (KI-Py G)染色、电镜技术鉴定细胞形态, 使用多功能酶标仪检测经 MPA 刺激的细胞活性, 台盼蓝染色法和 CCK-8 检测细胞存活率。结果显示, 获得的细胞大小均一, 细胞核圆形或肾形, 胞质有 A、B 型颗粒, 表面有皱褶, 具有中性粒细胞的形态特征; 细胞纯度达(99.3±0.53)%, 细胞活力达 (97.70±0.76)%, 在体外培养 24 h 内细胞存活率可保持在(89.91±3.56)%; 在 PMA 刺激下检测到细胞表达 MPO、 ROS、NO 和 NETs 的量显著提高(P＜0.05), 与刺激时间呈正相关。结果证实, 分离的细胞具有很好的活力, 具有中性粒细胞的功能特征。本研究成功建立草鱼中性粒细胞的分离方法, 细胞具有很好的活力, 可为深入研究鱼类中性粒细胞的功能和免疫机制提供基础。     

鳜SIRT3蛋白在传染性脾肾坏死病毒感染中的作用

沉默交配型信息调节因子 2同源蛋白 3 (silent mating type information regulation 2 homolog 3, SIRT3)是一种去乙酰化酶, 可调节线粒体氧化代谢。为探讨鳜(Siniperca chuatsi) SIRT3 在传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)感染中的作用, 本研究克隆分析了鳜 SIRT3 基因, 采用 qRT-PCR 和 western blotting 方法检测了病毒感染后 SIRT3 基因的表达, 并探讨了 SIRT3 对细胞代谢酶基因的表达和病毒增殖的影响。结果显示, 鳜 SIRT3 基因的开放阅读框全长 1350 bp, 编码 449 个氨基酸, 在鳜各组织均表达, 其中后肾中表达量最高, 脾脏中表达量较低; ISKNV 感染鳜脑细胞系和鱼体后, SIRT3 表达量均显著升高; 使用 SIRT3 抑制剂 3-TYP (10 μmol/L)和 siRNA 处理细胞后, 谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS)和谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, GDH)的表达量以及 ISKNV 产量均显著降低; 使用 SIRT3 激动剂 honokiol (7 μmol/L)处理细胞后, 代谢酶表达量和 ISKNV 产量均显著升高。结果表明, ISKNV 感染可通过 SIRT3 诱导宿主细胞谷氨酰胺代谢重编程, 进而促进自身增殖。     

大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白多克隆抗体的制备与应用

【目的】制备大口黑鲈蛙虹彩病毒主衣壳(MCP)蛋白兔多克隆抗体,以期为该病毒蛋白功能研究奠定基础。【方法】对pET32a(+)MCP/BL21重组大肠杆菌进行诱导表达,将重组蛋白进行纯化、复性,以此为抗原免疫大耳兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,间接免疫荧光试验（IFA）和Western Blot 法分析MCP多克隆抗体的特异性。【结果】纯化的MCP重组蛋白条带特异;间接ELISA结果显示,制备的兔多克隆抗体血清效价为1∶1 024 000;IFA和Western Blot检测结果表明该多抗特异性良好,能够与大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白发生特异性反应,IFA试验表明血清最适稀释度为1∶500。【结论】成功制备了大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP兔多克隆抗体,该抗体可特异性识别大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白。