中华鲟全人工繁殖技术研究

中华鲟(Acipenser sinensis)在人工驯养条件下性腺发育并最终成熟是突破中华鲟全人工繁殖技术的关键环节,有效的养殖模式对促进中华鲟性腺发育成熟、提前成熟以及实现雌雄同步成熟具有非常重要的作用.本研究在不同养殖模式(水温和营养调控)下对中华鲟性腺发育状况进行长期观测.结果显示,中华鲟在仿自然变温或恒温的养殖环境中,性腺均可发育至III期.采用配合饲料、饲料中添加鲜活鱼或冰鲜鱼以及仅用鲜活鱼或冰鲜鱼饲喂,均能够使部分中华鲟性腺发育启动,但添加鲜活鱼或冰鲜鱼组性腺发育启动的比例较高,其中,有3尾中华鲟性腺达 IV期.成功对性腺发育至IV期的1尾雌鲟(12龄,体质量57 kg)和1尾雄鲟(14龄,体质量64 kg)实施了人工催产和授精,采获卵6.25万粒,精液2850 mL,受精率为60.1%(36.3%~80.4%).在(19.3±0.2)℃下经过约125 h,仔鱼大量孵出,获初孵仔鱼2.3万余尾.此次中华鲟全人工繁殖技术研究的有效尝试可为今后养殖中华鲟的规模化繁育提供借鉴.  

从连续到偶发：中华鲟在葛洲坝下发生小规模自然繁殖

中华鲟(Acipenser sinensisGray)为国家一级重点保护野生动物,典型的溯河洄游产卵鱼类.历史上,中华鲟在长江上游及金沙江下游产卵,由于葛洲坝修建阻隔了其洄游通道,1981年以后在葛洲坝下形成了比较稳定的产卵场,1982―2013年,每年均有自然繁殖发生.由于其栖息生境退化,每年洄游进入长江的中华鲟繁殖亲本逐年减少,2013―2015年连续3年在已知葛洲坝下中华鲟产卵场未监测到中华鲟自然繁殖活动.2016年11―12月的野外监测发现,中华鲟在宜昌葛洲坝下已知产卵场发生了自然繁殖.其中底层网具采集到中华鲟鱼卵(卵膜)67粒、仔鱼22尾;解剖食卵鱼发现,10尾食卵鱼类共摄食中华鲟卵454粒;水下视频观测到5处中华鲟卵黏附底质位点.根据采集到的鱼卵发育期及采集位点推算,产卵时间为2016年11月24日凌晨,产卵场位于葛洲坝大江电厂以下约300 m的江段内,产卵日水温为19.7℃,流量为6610 m3/s,水位为39.7 m.  

氨氮胁迫对青鱼幼鱼鳃丝Na+/K+-ATP酶、组织结构及血清部分生理生化指标的影响

氨氮是诱发鱼病的主要环境因子,以初始体质量(7.00 0.14)g的青鱼幼鱼为研究对象,研究氨氮胁迫对其鳃丝Na+/K+-ATP酶、组织结构及血清部分生理生化指标的影响。实验设置低(对照组0 mg/L)、中(10 mg/L)和高(20 mg/L)3个氨氮浓度处理组,将暂养在自然淡水(对照)中的青鱼幼鱼分别放入各实验梯度中,进行0、6、12、24、48和96 h氨氮胁迫。结果表明:与对照组相比,中、高氨氮组鳃丝Na+/K+-ATP酶活性分别在12 h和6 h降至最低,然后升高,48 h达最大值,96 h后与对照组水平相当。鳃组织光镜观察表明,中氨氮组鳃小片基部泌氯细胞数量12 h有所增加,24 h呼吸上皮细胞出现部分脱落,96 h泌氯细胞出现空泡化,部分鳃小片充血;而高氨氮组鳃小片基部泌氯细胞数量6 h呈增加趋势,12 h呼吸上皮细胞部分脱落,24 h大面积脱落,96 h鳃小片基部严重充血。血清皮质醇和血糖含量在胁迫12 h均升高至最大,含量与氨氮浓度呈正相关,48 h恢复至对照组水平。氨氮胁迫下,血清总超氧化物歧化酶(SOD)活力呈先升高后降低的趋势,6 h时显著高于对照组(P<0.05),中氨氮组12 h后与对照组差异不显著,而高氨氮组96 h时显著低于对照组(P<0.05)。过氧化氢酶(CAT)活力12 h内均呈先降低后升高趋势,48 h均恢复至对照组水平。氨氮胁迫前期,血清总抗氧化力和谷胱甘肽均呈下降趋势,丙二醛和谷丙转氨酶活力呈升高趋势。谷胱甘肽和谷丙转氨酶活力在96 h恢复至对照组水平,而丙二醛96 h仍显著高于对照组,高氨氮组总抗氧化力显著低于对照组(P<0.05)。由此可见,氨氮胁迫初期,鱼体抗氧化系统受到严重干扰。随着胁迫时间延长,鱼体进行适应性生理调节,但机体抗氧化能力下降,鳃组织已受到损伤。  

达氏鳇胚后发育的形态观察

样本系黑龙江野外采集的达氏鳇(Huso dauricus)亲体经人工受精后孵出的子一代,对刚出膜的仔鱼[0日龄,体长(12.08±0.68) mm]到早期稚鱼[60日龄,(129.21±7.69) mm]的胚后发育形态进行了观察.从形态发育上看来,达氏鳇仔鱼的胚后发育可分为2个时期:早期仔鱼阶段,即从刚出膜(0日龄)到初次开口摄食(9日龄);晚期仔鱼阶段,即从初次开口摄食到各器官发育基本完成,体透明特征消失,鳍褶和颌齿彻底消失(50日龄),之后进入早期稚鱼期.早期仔鱼的形态发育和分化明显较晚期仔鱼和稚鱼快,运动、呼吸、感觉和消化等器官在此期间发育与分化快速同步协调,且速度快,使得仔鱼获得避敌与摄食能力,提高了成活率.晚期仔鱼发育主要表现为各骨板的分化和完善,鱼鳍游泳器官功能的进一步强化,鳔的发生和发育,表明此阶段游泳和躲避敌害能力进一步增强.  

尼罗罗非鱼幼鱼饲料的适宜脂肪需要

选用初始体质量为(46.14±4.67)g的尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica)360尾,随机分成6组(每组4重复,每重复15尾),分别饲喂添加鱼油水平为0%(对照组)、3%、6%、9%、12%和15%的纯化饲料(实测脂肪水平为0.20%、2.70%、6.11%、8.04%、11.13%和14.85%)。饲养8周后,以尼罗罗非鱼幼鱼的生长、体组成、血清生化及脂肪代谢酶活性等指标为判断依据,确定其饲料的脂肪需要量。结果表明,随饲料脂肪水平的升高,尼罗罗非鱼的增重率、特定生长率以及蛋白质效率均呈现先上升后下降的趋势,饲料系数呈现先下降后上升的趋势。饲料脂肪水平的升高使尼罗罗非鱼肝体比及全鱼和肌肉的脂肪含量显著增加(P<0.05)。随饲料脂肪水平的升高,尼罗罗非鱼血清总胆固醇和甘油三酯含量呈先上升后下降的趋势,各实验组显著高于对照组(P<0.05);血清高密度脂蛋白含量呈先上升后稳定的趋势;血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性均在饲料脂肪水平为6.11%时最小,在14.85%时达到最大。随饲料脂肪水平的升高,尼罗罗非鱼脂蛋白酯酶、肝脂酶和肠道脂肪酶活性均呈先升高后下降的趋势,脂肪酸合成酶活性显著下降(P<0.05)。对增重率、蛋白质效率、饲料系数和血清高密度脂蛋白胆固醇进行回归分析得出,尼罗罗非鱼幼鱼饲料最适脂肪水平分别为8.86%,9.75%,9.40%和8.30%,因此确定尼罗罗非鱼幼鱼饲料适宜的脂肪需要量为8.30%～9.75%。  

大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp 的片段, 克隆到 pMD19-T载体上, 构建重组质粒 pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后, 以10倍梯度稀释 pMD19-T-MCP重组质粒, 作为标准模板进行 TaqMan实时荧光定量PCR扩增, 制作标准曲线, 建立了大鲵虹彩病毒的 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系, 且线性范围宽, 相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示, 该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性, 与锦鲤疱疹病毒、弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌以及鲤上皮瘤细胞基因组DNA之间均无交叉反应, 特异性好, 检测总DNA灵敏度为10个病毒核酸分子拷贝数, 约1.1×10-3 pg/μL病毒核酸, 较之常规PCR的敏感度高出约1 000倍。研究建立的大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强, 对大鲵虹彩病毒病的快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。  

不同糖源对达氏鲟幼鱼生长、体成分及生理生化指标的影响

分别以糊精、小麦淀粉、玉米淀粉、α-淀粉(预糊化玉米淀粉)、蔗糖、葡萄糖为糖源,配制6种等氮等能的半纯化饲料,喂养达氏鲟(Acipenser dabryanus)幼鱼(68.05 g±1.63 g)8周,研究饲料中糖源对达氏鲟幼鱼生长性能、体成分及生理生化指标的影响.结果发现糊精、小麦淀粉、玉米淀粉、α-淀粉组实验鱼饲料效率和蛋白质效率显著高于蔗糖和葡萄糖组(P<0.05),玉米淀粉组实验鱼增重率、特定生长率和饲料效率最高.不同糖源对达氏鲟肥满度影响不显著(P>0.05),而对肝体比和脏体比均影响显著(P<0.05).肝体比和脏体比最高的为葡萄糖组,最低的为小麦淀粉组.小麦淀粉组全鱼、肌肉和肝中粗蛋白含量最高,葡萄糖组全鱼和肌肉的粗蛋白含量最低且均显著低于其他各组(P<0.05).糊精、蔗糖和葡萄糖组全鱼和肌肉粗脂肪显著高于其他各组(P<0.05).α-淀粉组肝糖原显著高于其他各组(P<0.05),α-淀粉组和葡萄糖组肌糖原显著高于其他各组(P<0.05).肝和血液中甘油三酯和总胆固醇含量和肌体和血液中糖水平呈正相关.不同糖源对达氏鲟消化道消化酶和肝丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶活性影响显著(P<0.05),对肝己糖激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性影响不显著(P>0.05).研究结果表明,在饲料中添加玉米淀粉作为糖源更有利于达氏鲟幼鱼生长.  

鲤疱疹病毒Ⅱ型的理化及生物学特性和超微形态发生

为了查明鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的理化与生物学特性以及病毒在细胞内的超微形态发生过程,利用新建立的对CyHV-2敏感的异育银鲫脑组织细胞系(GiCB),对CyHV-2的理化及生物学特性进行了详细研究,比较了不同来源鱼类细胞系对CyHV-2感染的敏感性,并对体外培养细胞中CyHV-2病毒粒子及其超微形态发生过程进行了电镜观察.结果显示,CyHV-2对热、酸、碱、有机溶剂和冻融敏感;常用鱼类细胞系EPC、RTG-2、Koi-Fin、CIK、CCK、PF-Fin对CyHV-2的感染不敏感,特异性巢式PCR检测盲传至第7代CyHV-2细胞培养物,结果均为阴性;CyHV-2在GiCB细胞中的增殖动态研究结果表明:病毒感染细胞经过12h的隐晦期,24 h开始进入对数生长期,96 h病毒滴度达到最高值(107.520.26 TCIDso/mL),然后进入平台期;透射电子显微镜观察结果显示,CyHV-2感染细胞可分为吸附与侵入、复制与装配、成熟与释放3个主要过程,病毒进入对数生长期后,被感染细胞内可见形态典型的疱疹病毒颗粒.  

鲤春病毒血症病毒糖蛋白的截短表达及其免疫原性分析

为了揭示鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus, SVCV)糖蛋白编码基因的主要免疫原性决定区域,本研究对 SVCV 的糖蛋白基因进行截短表达,并用纯化的重组蛋白作为免疫原制备了兔抗血清以分析其免疫原性。通过SOSUI以及DNAStar 6.0软件对SVCV糖蛋白基因的跨膜区、亲水性以及抗原表位进行分析后,采用RT-PCR 对该基因主要抗原决定区域编码片段进行扩增,并构建重组表达质粒 pGEX-Gtr,对其进行诱导表达后获得截短的 SVCV 糖蛋白的重组蛋白。将表达的重组蛋白进行纯化复性后,作为免疫原制备兔抗血清,采用 ELISA法检测其效价,采用免疫印迹以及间接免疫荧光技术检测该重组蛋白的免疫原性。研究结果显示,截短表达的糖蛋白编码基因长1317 bp,编码439个氨基酸(29~467),推测分子量为49.6 kD。利用该重组蛋白制备的兔抗血清,其与重组蛋白的反应效价为1∶64000,。免疫印迹及间接免疫荧光结果显示,该兔抗血清与SVCV-HN株能发生特异性反应,表明该重组蛋白与天然的病毒表面糖蛋白的免疫原性无差异。上述研究结果表明,截短表达的重组蛋白具有很好的免疫原性,可应用于免疫诊断技术研发与基因工程疫苗的研制。  

饲料维生素C水平对吉富罗非鱼生长性能、肌肉品质和抗氧化功能的影响

以维生素C多聚磷酸酯为维生素C(VC)源,评价了饲料VC水平对吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长、肌肉品质和抗氧化功能的影响。在基础饲料中分别添加0、60、300和1 500 mg/kg的VC(分别记为C 0、C 60、C300和C 1500组)配制成4种实验饲料,投喂初始体质量为(77.07±2.24)g的吉富罗非鱼56 d,实验分为4组,每组3个重复,每个重复20尾鱼。结果表明,饲料中添加VC可以显著提高吉富罗非鱼的增重率、特定生长率和成活率(P<0.05),但3个添加组之间无显著差异(P>0.05);各实验组罗非鱼肌肉的粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量不受饲料VC添加水平的影响(P>0.05),罗非鱼肌肉的水分含量以C 1500组最低,显著低于其余3组(P<0.05);C 300组罗非鱼肌肉的弹性和咀嚼性显著高于C 0组(P<0.05);C 1500组的肌肉硬度、凝聚性、弹性、黏性、咀嚼性均显著高于C 0组(P<0.05),各组的肌肉回复性无显著差异(P>0.05);VC添加组的罗非鱼血清和肌肉的超氧化物歧化酶(SOD)活性均显著高于C 0组(P<0.05),血清过氧化氢酶(CAT)活性以C 300组最高,显著高于C 0组(P<0.05),肌肉CAT活性有增高趋势但未出现显著差异(P>0.05),3个VC添加组的血清丙二醛(MDA)含量均显著低于C 0组(P<0.05),C1500组的肌肉MDA含量显著低于C 0组(P<0.05)。上述结果表明,饲料中添加适量VC(有效含量282 mg/kg)能提高吉富罗非鱼的生长性能,改善其肌肉品质,增强机体抗氧化功能。