Tgf2转座子介导的草鱼、团头鲂和鲫插入诱变研究

转座子介导的插入诱变(insertional mutagenesis)策略在养殖鱼类功能基因发掘和解释方面有着重要的研究意义。本研究以高效Tgf2转座子为研究基础,构建了pTgf2-β-actin-eGFP、pTgf2-EF1α-eGFP、pTgf2-Myo D-eGFP和pTgf2-Krt8-eGFP这4种带有不同启动子的供体质粒,以及pCS2-gf TP这种gf TP转座酶mRNA的体外表达的辅助质粒。将供体质粒和gf TP转座酶mRNA一起注射到草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、团头鲂(Megalobrama amblycephala)和鲫(Carassius auratus)的1~2细胞期受精卵中,经对子代增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)整合率的检测和筛选,初步构建了1个以转座子为工具介导的插入诱变库。实验表明,在早期胚胎中,鲫和团头鲂的荧光率达到90%,在草鱼中则高达95%,随着供体质粒注射的改变,表现出肌肉、表皮及全身不同的绿色荧光发光特征。eGFP基因平均整合率在3种鱼类子代平游期的为50%~53%,在1龄阶段为33.0%~36.1%。在3种鱼类中得到插入诱变突变体,获得草鱼阳性个体162尾,其中有45尾表型明显差异;鲫阳性个体60尾,其中有14尾表型明显差异;团头鲂阳性个体51尾,其中有10尾表型明显差异。结果表明,通过插入Tgf2转座子,可在草鱼、团头鲂和鲫等鲤科鱼类中实现基因组的插入诱变,本研究结果可为目标性状功能基因的挖掘和功能机制研究积累一定的基础。     

大口黑鲈组织蛋白酶B基因SNP筛选及其与生长性状关联分析

在动物体内组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)是以酶原形式存在于溶酶体中,能水解多种蛋白,是调控动物生长发育的重要候选功能基因。为开发与大口黑鲈(Micropterus salmoides)生长性状相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记,本研究对大口黑鲈EST-SNP库中CTSB基因上的SNP位点进行筛选。经PCR扩增和测序分析,从该基因中筛选到1个SNP位点(命名为C+598G),该位点属于错义突变位点,编码的甘氨酸突变成为精氨酸。采用Sna Pshot方法对C+598G位点在165尾大口黑鲈养殖样本中的基因型进行检测,并分析其在群体中的遗传多样性。结果显示,C+598G位点在养殖群体中存在CC、GC和GG3种基因型,其频率分别是40.6%、47.3%和12.1%,C和G等位基因频率分别是64.2%和35.8%;该位点在群体中的观测杂合度(Ho)和多态信息含量(PIC)分别为0.473和0.354,符合哈代-温伯格平衡定律。进一步分析不同基因型与大口黑鲈生长性状相关性,结果表明,3种基因型个体的体质量、全长、体高、尾柄长和尾柄高性状平均值从小到大依次为GG型、GC型和CC型,其中GG型个体在体质量上显著小于CC型个体(P<0.05)。本研究获得的C+598G标记与大口黑鲈生长性状显著相关,可作为大口黑鲈分子标记辅助育种研究中的生长标记。     

罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合蛋白免疫原性研究

为探究无乳链球菌LrrG(Leucine-rich repeat protein from GBS)和表面免疫原性蛋白Sip(surface immunogenic protein)串联表达的LrrG-Sip重组融合蛋白的免疫原性,该研究将原核表达的LrrG-Sip重组融合蛋白分别以0.5μg·g~(-1)(R1组)、1.0μg·g~(-1)(R2组)和1.5μg·g-1(R3组)每尾200μL腹腔注射免疫尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus),同时以Sip蛋白(S组)、LrrG蛋白(L组)以及PBS(P组)作为对照。2周后对所有免疫鱼体进行无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)人工攻毒,攻毒剂量为其半致死浓度(LD_(50):4.0×108CFU·mL~(-1))。结果显示LrrG-Sip重组融合蛋白R1组对尼罗罗非鱼的相对免疫保护率最高,达89.14%;且免疫后第14和第28天,该组鱼体血清抗体OD_(450nm)值分别达0.63和0.64,均显著高于单一蛋白对照组(S和L组)和PBS组(P0.05);R1组鱼体血清过氧化物酶(POD)和碱性磷酸酶(AKP)活性在上述2个时间点也显著高于其他组(P0.05);但溶菌酶(LZM)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性与其他组之间差异不显著(P0.05)。初步表明LrrG-Sip重组融合蛋白具有良好的免疫原性,其免疫原性明显优于单个蛋白,且能有效减少免疫剂量。     

生物膜水质修复技术处理水产养殖废水的研究进展

生物膜水质修复技术是利用附着生长于某些基质表面的微生物进行水质修复的一种方法。介绍了生物膜水质修复技术在水产养殖中的应用情况,阐述了生物膜的形成过程以及影响生物膜形成的因素,包括基质类型、放置密度及水体C/N等,并探讨了生物膜处理养殖废水对池塘生态环境和水产产量的影响。最后,展望了生物膜水质修复技术在水产养殖领域的应用前景和未来研究趋势,并指出生物膜技术是一种提高水产产量、净化水体、减少养殖废水排放的有效方法。     

蝇蛆抗菌肽对日本鳗鲡生长性能的影响

为了研究蝇蛆抗菌肽对日本鳗鲡生长性能及其成活率的影响,本文以日本鳗鲡幼鳗为研究对象,以鳗鲡基础日粮的普通粉料为对照组,对日本鳗鲡幼鳗的成活率、生长速度、相对增重率和饲料系数进行了比较分析。结果显示:试验期内实验组和对照组饲料系数分别为1.24和1.57,相对增重率分别为(193.6±8.74)%和(238.05±9.42)%。相比对照组,试验组成活率提高了9.13%,生长速度提高了22.9%以上,饵料系数降低了21%。试验结果表明:蝇蛆抗菌肽可显著提高日本鳗鲡的生长性能(P<0.05),降低养殖成本,不失为日本鳗鲡饲料的一种优质蛋白添加剂。     

混养鲮对凡纳滨对虾养殖池塘浮游生物群落结构的影响

为探索凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)适宜的养殖模式,跟踪调查了2口凡纳滨对虾养殖池塘[前期单养对虾,后期混养鲮(Cirrhinus molitorella)],测定了混养前、后养殖水体中浮游动、植物的群落组成,水质指标以及凡纳滨对虾生长情况。结果显示:混养后,养殖水体总氮、氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐含量均显著低于混养前(P0.05),磷酸盐含量显著高于混养前(P0.05),混养模式对虾养殖产量提高;经鉴定,混养前浮游植物共6门46种,混养后共6门44种,混养前、后对虾池塘浮游植物的密度和生物量分别为167.32×10~6个/L和7.84 mg/L、53.69×106个/L和4.24mg/L,混养后浮游植物密度及生物量均降低;浮游动物混养前共4门23种,混养后共4门17种,混养前、后对虾池塘浮游动物密度和生物量分别是3 014.6 ind./L和3.981 mg/L、1 201.65 ind./L和0.968 mg/L,混养后浮游动物生物量及密度均降低;混养后,浮游植物多样性提高,浮游动物多样性降低。以上结果表明,与单养模式相比,混养模式能降低养殖水体总氮、氨氮等含量,减少浮游生物数量,提高浮游植物多样性,同时降低浮游动物多样性,促进养殖水体藻相稳定,有利于提高对虾产量。     

四聚乙醛亚致死剂量对福寿螺AchE、GSTs和MFO活性的影响

为了解亚致死剂量四聚乙醛对福寿螺的主要靶标酶和解毒酶活性的影响,研究了0.50mg/L的四聚乙醛处理不同时间后福寿螺不同组织中乙酰胆碱酯酶(AchE)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFO)的活力变化。结果显示,四聚乙醛对福寿螺具有良好的杀灭效果,96hLC50为3.856mg/L,安全浓度为0.039mg/L;在用0.50mg/L的四聚乙醛处理的24h内,福寿螺鳃和腹足内AchE酶活力分别升高到未处理时的1.565和1.481倍而后下降,肝和肠组织内AchE酶活力分别下降为未处理时的0.132、0.282倍而后升高;不同组织中GSTs酶活力均呈现为"降低—升高—降低"的趋势;不同组织内MFO酶活力均为先下降后上升的趋势。研究表明0.50mg/L的四聚乙醛能诱导AchE、MFO和GST活性不同程度的增加,解毒酶MFO和GSTs可能在四聚乙醛的代谢中起着一定作用。     

杂交鳢养殖围隔上覆水—泥水界面—沉积物离子垂直分布特征及其界面交换通量

利用Peeper透析装置(dialysis peepers)的沉积物间隙水采集技术结合微量分光光度法,测定高密度杂交鳢养殖围隔中原位上覆水及沉积物间隙水中主要离子的浓度,分析各离子在上覆水–泥水界面–沉积物整个垂直剖面上的分布特征,并估算其在上覆水–沉积物界面处的扩散通量。结果显示,1NH4+-N、NO3–-N、NO2–-N、PO43–-P、SO42–-S和Fe2+都具有较强的垂直分布规律。NH4+-N在沉积物0~18 cm中随深度增加而迅速增加,18 cm后相对稳定;NO2–-N和PO43–-P在沉积物表层2~4 cm出现峰值,而在上覆水和深层沉积物中都相对较低;NO3–-N和SO42–-S在上覆水中远大于沉积物中浓度,并且进入沉积物4 cm内浓度迅速降低。2水样根据不同深度测定的理化性质,分别聚类为3组差异显著的类群:上覆水组、表层沉积物组(上覆水–沉积物界面组)和下层沉积物组。3通过Fick第一定律估算离子在上覆水—沉积物界面的扩散通量得出,NH4+-N、NO2–-N、PO43–-P和Fe2+为沉积物扩散至上覆水中;NO3–-N和SO42–-S为上覆水扩散至沉积物中。NH4+-N和SO42–-S在上覆水–沉积物界面具有相对较大扩散通量,其余离子则相对较小。NH4+-N在3个实验围隔中的扩散通量分别为76.432、111.631和209.835 mg/(m2·d),为主要的沉积物内源释放离子。     

双须骨舌鱼抗缪勒氏管激素基因amh的克隆、组织表达分析和原核表达

为探究双须骨舌鱼抗缪勒氏管激素基因amh的作用和表达模式,本研究通过RACE技术克隆了双须骨舌鱼amh基因全长c DNA序列,发现存在amh1、amh2两个亚型(Gen Bank登录号KU378662、KU378663)。序列分析结果显示,双须骨舌鱼amh1基因的c DNA全长2277 bp,编码623个氨基酸,amh2基因c DNA全长2181 bp,编码355个氨基酸。同源性分析显示,amh基因保守性较低,双须骨舌鱼与同科的美丽硬仆骨舌鱼相似度最高,为85.64%,与不同科鱼类的相似度均低于42%。系统进化分析显示,该基因与骨舌鱼目聚为一支,与鲱形目、鲤形目等较低等的硬骨鱼类亲缘关系较近,与双须骨舌鱼进化地位相符。用荧光定量PCR检测的结果显示,amh基因在双须骨舌鱼不同组织中均有表达,其中amh1亚型在精巢中表达量最高,且明显高于卵巢和其他组织;amh2亚型也在精巢中表达量最高,且明显高于其他组织,但远远低于amh1在精巢中的表达。构建了原核表达载体p ColdⅠ-amh1和p ColdⅠ-amh2并在大肠杆菌中成功诱导出大小分别为68和48 ku的融合蛋白,为进一步研究amh在双须骨舌鱼体内的生物功能奠定了基础。     

饲料糖脂比对吉富罗非鱼生长、血液指标和肝脏糖代谢关键酶活性及基因表达的影响

为探讨糖脂比对吉富罗非鱼幼鱼生长性能、血液生化指标和肝脏糖代谢关键酶的影响,本实验设计了5种不同糖脂比(1.5、2.3、3.9、7.0、16.5)的等氮等能饲料,以吉富罗非鱼幼鱼为实验对象,进行了为期8周的饲养实验。结果显示,随饲料中糖脂比升高,吉富罗非鱼特定生长率(SGR)、增重率(WGR)和蛋白质效率(PER)先升高后降低,糖脂比为3.9和7.0时,WGR、SGR和PER最高。饵料系数(FCR)的变化趋势与此相反,在糖脂比为3.9和7.0组显著低于其他组。随着饲料糖脂比的增加,吉富罗非鱼全鱼粗脂肪含量逐渐下降,在糖脂比为16.5时达到最低水平,但仅与1.5组存在显著差异。血浆甘油三酯在糖脂比最高组也出现显著降低,血浆胆固醇同样在糖脂比最高组显著低于3.9组。然而血糖的变化趋势相反,当糖脂比为16.5时显著高于其他组。随着糖脂比的升高,吉富罗非鱼幼鱼肝脏中丙酮酸激酶(PK)的活性及mRNA表达量逐渐升高,而磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的活性及mRNA表达水平则逐渐下降。根据二次回归模型得出,在等氮等能的饲料条件下,吉富罗非鱼幼鱼最适宜的糖水平和脂肪水平分别为49.69%和9.53%,其对应的糖脂比为8.4。